输尿管的近红外荧光腹腔镜检查用猪模型中的三种临床前染料

概要
背景
据报道，在1-7.6％的结肠直肠手术中发生输尿管损伤。为减少输尿管损伤的发生率，必须确定输尿管。在静脉注射染料中使用近红外荧光（NIRF）成像可能对腹腔镜检查期间的输尿管可视化具有附加价值。本研究的目的是评估三种临床前染料的性能; IRDye®800BK，IRDye®800NOS和IRDye®800CW，用于猪输尿管的近红外荧光腹腔镜检查。

方法
在三只雌性荷兰长白猪中，对新染料进行了评估。在每只猪中，使用浓度为1mg / ml的6mg静脉内剂量测试1种染料。使用腹腔镜成像系统以荧光模式和白光模式进行成像。为了进一步评估染料，进行了离体成像实验，其中在PBS中稀释的每种染料的8个递减浓度在透明的试管中用NIRF模式在距离的1.5和10cm的距离处进行评估。腹腔镜。

结果
所有三种染料都能有效地用NIRF成像鉴定输尿管。对于IRDye®800BK，IRDye®800NOS和IRDye®800CW，输尿管分别在35,45和10分钟后变为荧光，最大目标背景比（TBR）分别为2.14,0.66和1.44。在离体成像实验中，所有三种染料在所有浓度下产生强荧光信号并评估所有距离。

结论
静脉注射临床前染料IRDye®800CW，IRDye®800BK和IRDye®800NOS有助于成功识别活猪模型中输尿管的解剖过程。使用IRDye®800BK测得的TBR最高。在体外，在信号的荧光强度与染料浓度和与物体的距离之间观察到相关性。

关键词：荧光染料，腹腔镜结直肠手术;近红外荧光成像;输尿管
据报道，1％的发病率高达7.6％，输尿管损伤的发生是结直肠手术中令人担忧的并发症之一[1-4]。输尿管损伤可导致疼痛，腹腔内败血症，全身感染，脓肿，尿路，输尿管狭窄，输尿管瘘，肾功能衰竭和同侧肾脏单位丢失[4-6]。

未能确定相关解剖结构似乎是导致输尿管损伤的主要因素[7]。因此，为了避免输尿管损伤，必须在手术期间识别两个输尿管。然而，这可能是困难且耗时的。输尿管支架置入术是一种可用于开放手术以帮助识别输尿管的技术[4]。然而，在腹腔镜手术中，触觉反馈受到限制，这种应用几乎没有用。因此，需要一种改善腹腔镜手术中输尿管可视化的技术。近红外荧光（NIRF）成像的使用可能能够满足这种需要。这项技术已经用于肝胆外科手术，以显示胆管[8]或肝脏灌注[9]，并在结肠直肠手术中用于评估肠吻合的灌注[10-15]。关于使用NIRF成像识别输尿管的一些研究也已发表。

腹腔镜手术中最常用的荧光染料是吲哚菁绿（ICG）。然而，静脉注射这种染料不利于输尿管的可视化，因为它完全由肝脏清除，因此不能通过尿液排出[16]。或者，如果通过输尿管支架给药，ICG可能有可能使输尿管可视化[17,18]。这种技术的缺点包括其侵袭性，膀胱镜检查的要求和可能的并发症，如尿路感染，肾积水和血尿[4]。这表明在腹腔镜检查期间使用ICG对于输尿管的可视化来说是不太理想的选择。

以上说明需要一种有效的荧光染料，它可以静脉内给药，被肾脏清除并且没有副作用。先前的一项研究表明，临床前IRDye®800CW（LI-COR Inc.，Lincoln，NE，USA）在猪模型中提供了清晰的输尿管可视化[19]，因此有可能成为这种染料。由于这种染料对于这种应用来说非常昂贵，IRDye®800CW的制造商开发了两种新的，更便宜的染料：IRDye®800BK和IRDye®800NOS。这些染料在静脉给药后被证明在胆囊管和胆囊动脉可视化方面非常有前途[20]。它们都被肝脏和肾脏部分清除，这使得它们在静脉内给药后有资格用于输尿管的NIRF成像。

本研究的目的是评估IRDye®800BK，IRDye®800NOS和IRDye®800CW在近红外荧光腹腔镜检查中对猪输尿管进行可视化的性能。

材料和方法
该研究在马斯特里赫特大学（荷兰马斯特里赫特）的中心动物设施进行。动物的使用符合荷兰有关动物研究的法规，该研究是根据当地动物伦理委员会批准的方案进行的。选择猪模型是因为猪解剖学和人体解剖学之间的相似性以及早期在猪中成功应用NIRF成像[19]。实验在三只雌性荷兰长白猪（每只体重40kg）中进行。

腹腔镜荧光成像系统
使用具有基于氙的光源的腹腔镜荧光成像系统（Karl Storz GmbH＆CO.KG，Tittlingen，Germany）。该系统能够激发和检测本实验中使用的所有三种染料：IRDye 800CW（ʎEX/ EM = 775/796 nm），IRDye®800BK（ʎEX/ EM = 774/790 nm）和IRDye®800NOS（ʎEX/ EM = 767/786 nm）。所有程序均使用内置记录设备进行数字记录。对于所有测试的三种染料，使用相同的NIRF成像设置。

染料的特性和制备
IRDye®800CW是一种四磺化七甲基吲哚菁染料。静脉注射后，它被肾脏清除并排泄到尿液中。它也被肝脏部分清除并排泄到胆汁中。因此，它可用于胆管和输尿管可视化。其最大吸收发生在775nm，其最大激发发射在796nm。 IRDye®800CW的分子量为1090.11 Da [21]。

IRDye®800BK和IRDye®800NOS是两种新开发的染料。 IRDye®800BK是一种亲水性染料，最大吸收波长为774 nm，最大发射波长为790 nm。由于其亲水性，它主要由肾脏清除。这使得染料特别适用于术中输尿管成像。然而，肝脏有一些清除。

IRDye®800NOS亲水性较差，因此主要通过肝脏清除。这在理论上使其特别适用于胆道系统的可视化。然而，这种染料也部分地由肾脏排泄，因此也可以促进输尿管的可视化。最大吸收发生在767nm，最大发射在786nm。

按照制造商的说明制备和使用染料。

手术技术和评估指南
外科手术是在全身麻醉下进行的，如之前在早期研究中所述[20]。外科住院患者进行了腹腔镜下部分切除双子宫的子宫，模仿腹腔镜阑尾切除术。这些程序由两位专家内窥镜胃肠外科医生（NB和LS）严格监督。每只猪静脉注射三种染料中的一种，总剂量为6mg（1mg / ml）。

在荧光模式和白光模式下间歇地进行成像。术中，第一作者（MA和JvdB）通过填写登记表，系统地记录是否可以通过荧光模式识别输尿管。咨询了主治外科医生，以便就输尿管的识别达成一致意见。如果经验丰富的外科医生确定其定位，则将结构定义为“已识别”。

离体NIRF成像
在离体实验中，在完全变暗的房间中以NIRF模式评估在PBS中稀释的8个降低的染料浓度，腹腔镜分别保持在1,5和10cm的距离。在透明的1​​0ml试管中装入10ml各染料浓度。初始稀释液由10毫克染料稀释于10毫升PBS中组成。从该碱性浓度，降低染料浓度。评估的染料/ PBS浓度为1：1,1：2,1：4,1：8,1：16,1：32,1：64和1：128。

术后分析荧光
为了客观评估荧光照射，使用OSIRIX Lite v9成像软件（Pixmeo，Geneva，Switzerland）。通过确定荧光强度（FI）和靶 - 背景比（TBR）来分析荧光。通过这样做，可以客观化目标器官（输尿管）与周围组织相比是否更加荧光。 TBR定义为目标（输尿管）中三个感兴趣点的平均荧光强度（FI以任意单位，AU），减去背景中三个感兴趣点的平均荧光强度除以三个平均荧光强度背景中的兴趣点。式中：TBR =（目标的FI  - 背景的FI）/（FI背景）[19,20,22]。在这些感兴趣的点上避免了具有光散射的区域。由于完全变暗的房间，离体实验中的背景FI可忽略不计，因此没有计算出TBR。

对于目标的FI，在输尿管中选择三个位于中心的感兴趣区域。这三个区域的平均荧光强度是目标的FI。使用此技术建立TBR时，选择可重现的背景非常重要。因此，作为背景3，在体内研究中选择距离输尿管1cm双侧（右侧2个和左侧1个）的感兴趣区域。这三种荧光强度的平均分数用作背景的FI。

对于离体研究，选择填充有染料稀释度的试管中心的三个目标区域的平均值作为靶标。

结果
在所有三个实验中，有可能通过NIRF成像成功识别输尿管。在手术期间获得的结果以表1中的术中登记表格呈现。荧光模式的代表性屏幕截图由三只猪中的每一只制成。

表格1
术中登记表

首次见证输尿管的鉴定是在用三种染料染色后几分钟内发生的。 输尿管壁与子宫，肠和淋巴结一起在NIRF模式下变为荧光。 尚未看到输尿管内尿液的蠕动。 因此，作者无法在此阶段绝对确定输尿管的过程。

在IRDye®800BK染料给药后35分钟，由于尿液中排出的荧光染料，尿液的蠕动运动在NIRF模式下清晰可见。 在染料给药后3.5小时，输尿管保持荧光直至最终评估。 测得的最高TBR为2.14（图1a）。


图1
使用实验染料可视化输尿管：a使用IRDye®800BK，最高TBR（2.14），b使用IRDye®800NOS，最高TBR（0.66），c使用IRDye 800CW，TBR最高（1.44）

第二只猪（IRDye®800NOS）中输尿管的荧光首次出现在染料给药后45分钟，输尿管内有明显的尿蠕动。测得的最高TBR为0.66（图1b）。

在第三只猪中，在施用IRDye®800CW染料后10分钟发生输尿管的第一次荧光成像。两种输尿管都与周围环境明显不同。在染料施用后25分钟的第二次评估显示在NIRF模式下输尿管的持续清晰描绘。测得的最高TBR为1.44（图1c）。

在任何实验中均未观察到并发症或不良反应。

离体NIRF成像
使用所有三种染料，在所有浓度和所有距离下都获得了强荧光信号。结果如图2a-c所示。


图2
用于不同染料浓度的三种染料的荧光强度（FI），腹腔镜保持在离物体1cm，b5cm和c10cm处。 1：1,2：1等：初始染料浓度的稀释液（见文）

在1厘米距离处，所有浓度的所有染料都显示出相当的FI，没有明显的波动。在5厘米距离处，所有染料的FI在最高浓度下较低。在这些浓度下，IRDye®800CW显示出最高的FI。这种效果在较低浓度下消失。在10cm距离处，对于所有三种染料也观察到浓度和FI之间的反比关系。与IRDye®800NOS相比，IRDye®800CW和IRDye®800BK在所有浓度下都显示出更高的FI。当腹腔镜保持在10cm距离时，与分别保持在1和5cm距离时相比，所有三种染料均显示FI减少。对于较高浓度，在1cm距离处实现最高FI，对于较低浓度，在5cm距离处实现最高FI。

讨论
最常用的近红外荧光染料吲哚菁绿仅由肝脏清除[20]，因此静脉注射后不能用于输尿管成像。这种成像需要在尿液中排出的染料或输入输尿管的侵入性技术，荧光染料可以通过输尿管插入其腔[18,23]。

Verbeek等人。在12例患者的开放式盆腔手术中使用亚甲蓝作为荧光染料用于输尿管可视化。在所有12名患者中，输尿管可以清晰可见[24]。 Yueng等。显示11名患者中有10名患者输尿管可视化。该技术在这10个案例中有4个被认为是有用的。 Barnes等人最近的一项研究。在一项临床研究中显示了有希望的结果，允许输尿管的可视化，其中亚甲蓝的荧光成像与评估的69个输尿管中的14个中的白光相比具有附加值[25]。然而，在腹腔镜结肠直肠手术中使用亚甲蓝作为荧光染料的另一项研究中，在任何一种病例中都没有发现这种技术优于传统的白光腹腔镜检查[26]。尽管在这些研究中没有报道副作用，但使用亚甲蓝的缺点是它具有一些潜在的副作用，例如过敏反应的风险很小[27]和血管收缩的可能发生。

一种有前途的近红外荧光染料被肾脏清除，是IRDye®800CW[23]。但是，这种染料对于这种应用是昂贵的。生产成本较低的较新的临床前染料是IRDye®800NOS和IRDye®800BK。制造商估计其成本在商用ICG（个人通信）的范围内。在本研究中，探讨了三种临床前染料对输尿管NIRF成像的有效性。 IRDye®800BK专为通过尿液排泄而开发，具有亲水性。因此，预计该染料将等于或优于先前针对IRDye®800CW所述的成像能力[20]。

所有三种染料都能使两种输尿管的解剖过程清晰可见，如图1a-c所示。使用IRDye®800BK测量最高的最大体内FI和TBR，并且在IRDye®800NOS中发现最低的最大FI和TBR。这符合预期，因为亲水性IRDye®800BK主要由肾脏清除，而IRDye®800NOS亲水性较低，仅部分被肾脏清除。然而，所有三种染料都能清楚地看到输尿管。 IRDye®800CW的TBR与之前的实验相当[19]。

在离体研究中，在所有浓度和所有测试距离下都获得了清晰的荧光信号。当腹腔镜保持在1和5cm距离时实现最高FI，而在10cm距离处实现最低FI。这支持早期的研究，这些研究表明，腹腔镜距目标的距离增加会对FI产生负面影响[28]。

评估更多浓度和距离的进一步研究可能有助于确定理想的距离/浓度组合。

由于染料的给药，没有不良反应。使用静脉注射荧光染料已知SpO2氧饱和度短暂下降，暂时导致氧含量错误降低[29,30]。这些新染料相对于含碘ICG的优点是这些染料也可用于已知对碘或碘过敏的超敏感性的患者。由于评估的猪数量较少，尚未得出关于染料安全性的结论。

尽管结果很有希望，但本研究的结果必须谨慎解释。由于每种染料仅在一种特定剂量下在体内进行测试，并且每种染料仅在一只猪中进行测试，因此需要进一步的实验来确定染料的最佳剂量和时间，这取决于染料的药代动力学性质。此外，应该等待人类受试者的测试以评估染料的临床价值。

结论
静脉注射临床前染料IRDye®800CW，IRDye®800BK和IRDye®800NOS可以成功识别生猪模型中输尿管病程的NIRF。 IRDye®800BK的使用导致输尿管和背景之间的对比度最高。

在体外，观察到信号与染料浓度和与物体的距离的相关性。

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