在猪疝模型中使用亲和聚合物包被的合成网状物进行感染预防

概要
背景
由于对疝网感染的关注，外科医生经常使用生物网，这可以提供降低的感染风险，但代价是降低修复耐久性。作者评估了网状涂层，以提供抗生素的持续释放，以防止假体网状物感染，并且还允许持久修复。

材料和方法
将基于环糊精的聚合物交联到复丝聚酯网上并装载万古霉素（1.75mg / cm 2）。猪接受改良网状结构（n = 6）或正常，未经治疗的网状结构（n = 4），将其植入急性10×5cm腹侧疝，然后直接接种106株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌落形成单位（CFU） （MRSA）。将这些与接受正常未感染网的动物进行比较。所有网状物均以底衬桥接方式固定，30天后取出腹壁进行定量细菌培养和生物力学分析。

结果
所有动物存活30天。所有六只涂有网状物的动物都清除了MRSA感染。四只对照动物未清除MRSA（P = 0.005）。标准筛网与药物递送筛网组的定量细菌负荷较高（2.34×104对80.9CFU / gm）。这些数据经log10转化并通过Welch t检验进行分析（P = 0.001）。使用通过测定（300）可检测的最小CFU数而不是零。对照的生物力学分析（1.82N / mm感染; 1.71N / mm未感染）显示组织整合中的修饰网格（1.31N / mm）没有差异（P = 0.15）。

结论
作者成功地使用基于环糊精的聚合物在猪模型中防止合成网状物感染，以将万古霉素局部递送至疝气修复部位并清除抗生素抗性细菌。聚合物涂层不影响疝气修复的强度。

关键词：疝气，感染，网状，猪，合成，聚酯，治疗，预防，环糊精，涂层，万古霉素

介绍
假体材料的出现通过显著降低疝气复发率，彻底改变了疝气手术。假体网的理想特性自首次引入以来几乎没有变化，提供持久的修复，同时降低潜在并发症的风险，包括感染，慢性炎症和腹腔内粘连。尽管其中一些领域取得了进展，但作者缺乏预防假体网状感染的适当选择.1,2

植入后长达一年的网状感染可能会被认为是植入时污染的结果。目前可用于治疗这种感染的选择依赖于高剂量的全身性抗生素，这些抗生素提供了不同的渗透性。此外，这些疗法使患者面临相关并发症的风险，包括艰难梭菌和耐药性生物的发展.4 尽管进行了最积极的治疗，但是假体装置感染经常需要移除装置。

因此，许多外科医生不是治疗感染，而是转向预防感染。目前的主线治疗包括围手术期抗生素，目的是获得足够的局部组织水平以防止细菌生长。作为一种辅助手段，一些研究人员正在评估药物输送聚合物的可能性，这些聚合物可用于涂覆假体装置，以试图提供持续的局部药物水平。最初的研究显示了不同的成功5,6，因为这些聚合物通常仅依靠扩散来释放药物，导致高度非线性的特征，大多数药物的快速爆发在数小时到数天的数量级，几乎没有留下在以后的日期交付。这种基于扩散的双相释放具有在初始时间点药物过多和在稍后时间点药物过少的潜在后果，这是产生耐药细菌的完美风暴。鉴于近一年的疝网感染窗口，作者假设需要更长，更持久的分娩方式来杀死细菌和预防感染。

作者的团队已经成功开发了一种基于亲和力的聚合物，可以提供数周至数月的可控和持续的抗生素释放。这项工作利用体外和体内模型证明作者能够涂覆样本（~0.7×0.7 cm）的假体网并防止啮齿动物皮下金黄色葡萄球菌感染.7-9本研究的目的是扩展作者以前的工作和评估装载万古霉素（VM）的聚合物涂层网的能力，以防止耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染，同时提供持久的腹侧疝修复。

方法
创建修改后的网格
将在0.2M氢氧化钾中的30％（wt / wt）环糊精预聚物（CD）溶液与乙二醇二缩水甘油醚（EGDGE）以1：0.7的CD：EGDGE的摩尔比混合。将15cm×10cm的聚酯网（Parietex TET，Covidien，Mansfield，MA）均匀地涂覆20mL的CD-EGDGE溶液;使聚合物在聚酯网上通过碱催化的环氧化物开环在室温下在密封的不锈钢托盘中交联5天。除去聚合的CD（pCD）涂覆的网状物并在蒸馏水中充分洗涤3天，定期更换水以洗掉过量的试剂。洗涤后，将每个筛网部分干燥并通过将聚合物涂覆的筛网在5％（wt / vol）VM水溶液中温育2天来装载VM。 2天后，短暂冲洗网状物以除去过量的未结合的药物;暴露在紫外线下，每侧20分钟进行消毒;然后保存在密封的塑料容器中直至使用。先前已报道了对这些和类似网格的广泛化学和物理表征[7,8]

菌
将MRSA（Xen30，Caliper LifeSciences，Hopkinton，MA）的临床菌株培养过夜，以1:50稀释，然后置于37℃振荡器中，使细菌达到108菌落形成单位（CFU）/ mL的浓度。基于光密度。用无菌0.9％生理盐水（NS）中的连续稀释液稀释该溶液，得到浓度为10 6 CFU / mL。然后使用一立方厘米的液体在将网固定到位之后并且在如下所述闭合伤口之前接种网。

动物 - 手术修复
在手术前7天，将约克夏雌性猪（30-35千克; Pineview Farms，Valley City，OH）适应作者的设施。由于雄性和雌性之间腹部组织成分之间的巨大差异，在该初步研究中，仅使用雌性动物。所有动物护理和操作程序均按照美国公共卫生服务实验动物护理指南（NIH Publication 85-23,1985）进行，并在事先获得Case Western Reserve大学机构动物护理和使用批准的情况下进行。委员会。手术麻醉的诱导包括肌内注射Telazol（6-8mg / kg），然后进行气管内插管，并用吸入的异氟烷（2％-5％）维持麻醉。使用局部注射Marcaine（5％稀释1:10），然后在前72小时使用芬太尼贴剂（25μg）获得术后疼痛控制。在任何手术之前和尸检时，将腹壁夹住并用70％氯己定溶液制备。动物接受单次，术前剂量的全身性抗生素（Baytril 7.5mg / kg）。

通过在脐部上方创建10厘米中线剖腹手术开始手术修复。然后将颈阔肌肌肉从直肌和外斜肌中释放出来。使用电烙术从左侧和右侧移除直肌（~2.5cm）以产生10cm×5cm的最终缺损。然后使用装载有VM或对照聚酯网（Parietex TET，Covidien，Mansfield，MA）的pCD涂布的网状物随机分配动物进行修复。使用15cm×10cm的网片以底衬桥接方式修复缺陷，其在每个方向上提供2.5cm的网格组织重叠。在接种MRSA的动物中，6只动物接受环糊精聚合物包被的载药网状物，其中4只动物接受标准的未修饰的网状物。将这些与使用标准的未修饰的网状物进行腹侧疝修复但未被感染的动物进行比较。

每隔2-3厘米放置间断的0-聚丙烯筋膜缝合线固定网状物。在闭合伤口之前，将感染组中的动物用106CFU的MRSA直接接种到网中，如上所述。用跑步的2-0聚乳酸缝合线封闭皮下组织，然后用皮下4-0聚乳酸缝合线缝合皮肤。

尸体剖检
在疝气修复后30天对动物实施安乐死。将腹壁夹住并用70％氯己定溶液制备以除去皮肤菌群。使用无菌技术进行全厚度腹壁外植体。从每只动物获得两个样品用于生物力学测试。获得另外两个样品用于定量培养。

细菌培养
称重所有样品，置于10mL无菌NS中，均化，然后在NS中连续稀释10倍。将原始悬浮液和所有稀释液以100μL体积接种在含有5％羊血的TSA平板上，并在37℃下孵育24小时。从显示每板30-300CFU的平板定量细菌生长，并基于每个样品的重量表示为CFU / g样品。细菌清除率（百分比）定义为培养物中没有MRSA生长的动物数除以特定组的动物总数。

生物力学
使用标准化的组织压力机将样品（每只动物n = 2）切成哑铃形状，将压力机定心在网状组织界面（7mm宽×40mm长）上。在安乐死的4小时内，在具有FlexTest SE控制器（MTS，Eden Prairie，MN）的Instron 5543框架（Instron，Norwood，MA）上在36℃的盐水浴中进行单轴机械测试。将所有样品在50g下预处理10个循环，然后以4mm / s的速度进行恒速斜坡破坏试验。网 - 组织界面的拉伸强度定义为标准化的最大应力（最大力除以样品宽度;牛顿/ mm宽度）。来自未感染的猪的网状组织界面样品先前使用该技术进行分析并用于基线比较。

数据分析
使用Stata版本10分析数据。在培养研究后计算细菌清除百分比和平均细菌计数（CFU / g）。出于统计目的，当从细菌培养物中未检测到MRSA时，正常的微生物学程序是将值设定为不是“0”，而是设定可重复检测的最小菌落数（300CFU）。在统计分析之前对数据进行log10转换。在两个研究组中比较平均拉伸强度（N / mm）。在适当的时候使用Welch的不等方差t检验和Fisher精确检验。对于所有测试，P值<0.05被认为是显著的。

结果
研究中包括10头猪;四只对照动物用非涂层聚酯网进行修复，六只动物用装有VM的pCD包被的网进行修复。在术后期间没有并发症，并且所有动物在整个研究期间存活。

细菌分析
30天后，用标准聚酯网修复的所有对照动物都显示出细菌污染的主观迹象（图1A和B），而所有pCD涂层网没有任何明显的污染迹象（图1C和D）。当评估细菌清除时，所有pCD包被的样品（6/6）成功清除接种的MRSA并且在细菌培养物上没有可检测的生长。相比之下，没有（0/4）的非涂层聚酯动物能够清除细菌负荷（P = 0.005）并且平均MRSA生长为2.34×104CFU / gm，而pCD涂层网中没有可检测的生长（平均80.9 CFU / gm）。来自对照组的细菌计数范围为8400至56,700CFU / g（表1），由于这种差异，所有定量培养数据在统计分析之前通过Welch的t检验记录log10转化，考虑异方差性.10 log10之后 - 转化，pCD涂覆的网与聚酯网状对照显著不同（P = 0.001;表1）。


图1
在研究终点（30天）拍摄的图像。 这些图像代表感染/未治疗的网状病症（A和B）和抗生素递送网状况（C和D）中的动物。 没有感染的对照动物看起来类似于（C和D）并且未示出。 除了明显的腹胀外，感染/未治疗的动物显示出广泛的感染迹象以及炎症/免疫应答（B）（A）。 接受抗生素递送网的动物显示出优异的疝修复（C）和腹部皮瓣上的最小炎症和瘢痕（D）。 （图的彩色版可在线获得。）

表格1
本研究中所有受感染动物的细菌计数。

接受标准未修饰网格的四只对照动物在研究终点（30天）显示广泛感染，平均为2.34×10 4 CFU。接受抗生素递送网的六只实验动物均未显示存活的细菌。即使没有检测到细菌，根据微生物标准，所有条件都设定为300CFU，这是这些实验条件下的最小可检测单位。

*将具有0个菌落的样品设定为300CFU的最小可检测单位。
生物力学分析
通过生物力学分析，作者确定在所有测试条件下网 - 组织界面的拉伸强度没有显著差异（图2）。样品包括（1）非涂层，感染网（1.82 N / mm），（2）未涂层，未感染网（1.71 N / mm），和（3）pCD涂层网（分别为1.31 N / mm; P = 0.15） ）。所有测试的样品在网格 - 组织界面处具有失效点。未来的研究可以研究长期机械强度差异，因为组织重塑在30天后继续发展。


图2
在研究终点（30天）的样品的机械测试（组织整合强度）。对于三种条件对所有样品进行机械拉伸强度测试：（1）未感染的对照动物接受正常网状植入物而没有引入感染; （2）感染对照动物接受正常网状植入但接受106 CFU的MRSA; （3）动物接受抗生素输送网状植入物以及106 CFU的MRSA的实验条件。三种条件之间没有显著差异（P = 0.15），并且所有测试样品在网格 - 组织界面处具有失效点。

讨论
假体网状感染仍然是疝气手术中的重大挑战。这项研究代表了作者正在进行的评估使用pCD涂层预防假体网状感染的工作。作者之前已经证明，用装有VM的pCD涂覆一块聚酯网将成功地防止直接接种后30天的MRSA网状结构感染。这项工作是在腹侧疝修复术中使用这种抗生素传递技术的初步调查。此外，用pCD聚合物涂覆聚酯网不会显著改变网状物提供持久的腹侧疝修复的能力。

由于Luijendijk等[11]首次报道了在修复疝修补术时使用修复网的作用，假体网已成为外科医生的主要支柱。尽管网状设计和制造方面取得了进展，但在预防假体网状感染方面已经取得了很少的进展，最近的研究表明，网状感染的风险在10％到25％之间.13,14此外，一些研究报道了网状感染。植入后33个月发生.15越来越受关注的是社区和医院中MRSA感染的普遍流行[1,16] MRSA可能形成生物膜，这种生物膜很难根除许多人已经转向在这些患者中使用生物移植物.1然而，首先防止网状感染发生的能力可能更值得。

目前，DualMesh Plus（Gore，Flagstaff，AZ）是唯一可商购的合成网，其主要目标是减少假体网状感染。 DualMesh Plus由聚四氟乙烯负载二乙酸氯己定和碳酸银制成，依赖于高度非线性，基于扩散的“爆发型”释放原理，药物迅速从网状物中的高药物浓度扩散到局部组织。然而，DualMesh Plus的活动持续时间仅限于14天，并且药物的释放模式是快速和非线性的，导致在最初几小时到几天内释放的百分比很高.9,17这种快速释放已经与通常具有有害临床反应的全身性炎症反应有关[18]并且临床数据尚不清楚这种网状物是否提供降低的感染率和预防生物膜形成.1,12,19,20最近批准的XenMatrix AB（Bard，Murray） Hill，NJ）为临床医生提供了另一种抗菌疝网状解决方案。 XenMatrix是一种涂有米诺环素和利福平的生物（猪皮肤移植物）。由于网状力学，再吸收和免疫/炎症反应的差异，很难直接比较这种生物网和这里研究的合成网。但是，该网格的批准表明了在该产品领域成功解决方案的强烈需求。

本研究中使用的pCD聚合物利用称为基于亲和力的药物释放的技术。释放中的限速步骤主要基于所选药物（在该研究VM中）与包含聚合物的CD之间的化学亲和力。抗生素释放速率可以通过调节pCD聚合物的组成（例如，转换CD-α，β或γCD的类型，其环包含不同数量的葡萄糖残基;或改变交联）或选择不同的抗生素来调整。除了假体疝网之外，这种基于pCD的递送聚合物可用于涂覆其他基底，例如整形外科装置，例如全膝置换植入物。

设计pCD涂层网的最初挑战是获得均匀的薄膜，然后优化释放曲线以提供更长的杀菌活性，这在临床上是重要的。使用pCD包被的聚酯网进行的初始体外研究表明，当与疏水性药物如利福平结合时，持续的抗菌活性在40天以上。鉴于CD的疏水口袋的性质，当pCD聚合物与更亲水的药物如VM结合时，抗微生物活性的长度稍短但仍提供致死剂量的抗生素超过14天.8 MRSA的临床作用在假体网状感染中，需要进一步研究VM与pCD聚合物的使用.19,21

最初的体内研究调查了载有VM的pCD包被的网状物在小鼠皮下模型中抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力.7将装载有VM的pCD包被的网状物的样品与经过处理的网状物的标准（即，非包衣的）样品进行比较。使用本地VM刷新。在2周和4周时，金黄色葡萄球菌感染在VM冲洗组中持续存在但在pCD包被的网状组中检测不到。除了证明CD聚合物在体内抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力之外，该工作还提供了对CD聚合物涂覆的网状物的安全性和无毒性质的初步了解，因为没有观察到总毒性或过度的异物反应。然而，该研究没有评估pCD涂层网修复实际疝缺损的可能性，以及载药涂层网可能对所需的网状组织整合有何影响。

目前的初步研究的目的是评估pCD涂层网在感染腹侧疝修复中的应用。与对照聚酯网相比，用装有VM的pCD包被网修复的动物能够100％清除MRSA感染，对照聚酯网没有一只动物（0/4）能够清除106 CFU细菌负荷（P = 0.001），并且不影响修复的耐久性。该研究仅调查了30天。感染可能只是被压制而且没有完全根除，因此未来的工作将探索长期终点。然而，在所有动物（6/6）中，在30天时没有可检测的生长。据推测，如果存在任何细菌，但在生长期间它们会被识别出来。

与全身抗生素给药相比，pCD聚合物涂层的另一个好处是所需抗生素的显著剂量减少。在这项研究中，每个疝缺损用15厘米×10厘米（面积150平方厘米）的pCD涂层网片修复，该网片装有1.75毫克/厘米2的VM。因此，总VM剂量为约262.5mg VM，其为给予患有网状感染的患者的单次静脉内剂量VM的约四分之一。这种对较少药物的需求将显著降低全身水平，限制昂贵的不良反应的可能性，并且通过以尽可能最有效的方式直接向缺损部位递送药物来提供驱动抗生素抗性的最低可能性。这种局部分娩的目的是提供足够的量来根除局部细菌，但不能达到高的全身水平。

用于腹侧疝修补术的任何网状物必须提供持久的修复，良好的组织向内生长进入网状物。尽管该研究代表了相对较小的一组动物（n = 10），但是当生物力学测量时，pCD聚合物涂层不会显著干扰网 - 组织界面的拉伸强度（P = 0.15）。在这项工作中使用的疝气修复的底衬桥形式不一定是临床上优选的修复方法，但在评估网状物提供持久修复和清除细菌污染的能力时确实是最坏情况。同样，作者使用未修改的或标准的网格作为受感染的对照来提供最坏情况，并且情况类似于临床上看到的情况。

本研究初步评估了在腹侧疝修补术中使用pCD涂层网的可行性。需要进一步研究从网状物释放的局部和全身药物水平。此外，本研究仅评估了30 d的单个时间点。虽然作者之前已经在体外显示出长期（> 40天）的抑制作用，但应该进行8个体内时间点以研究长期抗菌活性。此外，虽然没有具体研究长期生物相容性，但短期观察结果显示，对毒性或异物反应没有任何担忧，与啮齿动物研究中的情况相比。然而，评估异物对pCD聚合物涂层的反应对于成功进行长期疝修补至关重要。

尽管网状设计有显著进步，但腹侧疝修复后的假体网状感染仍然是一个重要问题。该研究利用基于亲和力的药物递送系统来预防腹侧疝模型中的网状感染。正在进行评估细胞和分子水平的长期影响和生物相容性的其他工作。

参考：
Infection prevention using affinity polymer-coated, synthetic meshes in a pig hernia model
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