血管化骨膜瓣作为修复软骨缺损的新型组织工程模型

概要
骨膜是一种有前途的组织工程支架，用于软骨修复研究;然而，到目前为止，由于移植物的营养不足，骨膜转移尚未成功实现。在转移方法中，作者首次将血管化的骨膜瓣设计为具有自身血液供应的“独立”生物材料，以解决该问题并重建外周软骨缺损。在6只3个月大的新西兰兔中，股骨内侧髁突的一个临界尺寸的软骨缺损被创造并覆盖在带有隐静脉血管的血管化骨膜瓣上。 28天后，通过生物力学压缩测试以及通过免疫组织化学在分子生物学水平上宏观地，组织学和定性地评估新建软骨的形成。所有伤口完全愈合，所有关节稳定，并具有全方位的运动。所有皮瓣均存活并通过其脉动蒂灌注。它们表现出对骨骼的稳定附着，尽管部分不完全粘附。在转移的皮瓣中形成具有典型柱状细胞分布和阳性胶原蛋白II染色的透明软骨。生物力学测试显示，最大负荷显著高于阳性对照，但弹性较低。这项研究证明，骨膜瓣的血管化是皮瓣存活的必要步骤，并使皮瓣转变为软骨。似乎可以重建外皮软骨缺损。虽然这些是试点项目的第一批结果，但作者相信，这种技术可以在临床领域具有广泛的潜在应用和高度相关性。

关键词：软骨修复，组织工程，血管化骨膜瓣，转化研究，骨关节炎，软骨缺损

介绍
由于关节软骨既不具有血液供应也不具有间充质干细胞（MSCs）的来源，因此在受损或患病时其自身修复的可能性有限1.骨膜中的MSC已显示在体​​内和体外分化为新软骨细胞2- 5具有在特定前提条件下形成软骨的可能性，例如转化生长因子-β1（TGF-β1）或剪切应力6,7。这是自体骨膜移植（骨膜关节成形术）作为修复关节软骨缺损的治疗选择的科学依据。

迄今为止，膝关节骨性关节炎仍然是一种不可治愈的疾病。标准手术技术包括关节镜清创术，软骨细胞自体移植，转位截骨术和部分或全关节置换术。由于几个方面，骨膜是软骨再生研究中有前途的组织。一个优点是骨膜组织满足组织工程的三个要求。首先，因为骨膜组织可以作为整个组织移植，它可以作为自己的支架或基质。其次，它提供了具有形成软骨8的潜力的多能MSC的来源，并且它产生了促进细胞生长和分化的生物活性因子。在导致软骨形成的条件下，通过骨膜合成涉及调节软骨细胞和软骨发育的许多生长因子。这些包括TGF-β1，胰岛素样生长因子-1，生长和分化因子-5，骨形态发生蛋白-2，整合素和这些分子的受体8。

关于通过骨膜组织在这个有前途的软骨工程领域中的各种先前使用的模型，存在具有不同组织转移设计的几种体内模型。然而，所有这些都与游离的，非血管化的骨膜转移一起工作，导致缺损的不完全填充和大多数纤维组织的发展而不是透明软骨9. 由于转移组织的充分营养是必不可少的前提条件，并且在骨膜组织不仅可能通过滑液发生，作者认为血管化的骨膜瓣模型是关节软骨修复的下一个必要步骤。

通过这个项目，作者希望将通过整形手术获得的知识和经验与损伤组织的再生和重建与退行性软骨缺损和关节炎的常见骨科疾病相结合。

作者想证明作者的假设，即通过专用椎弓根的组织营养是转移的骨膜组织存活和转化的最重要方面。随着使用血管化骨膜瓣的新技术，作者希望建立一种新的方法和组织工程软骨再生的手术模型，并迈出创建由自体材料开发的生理，健康和负重的新软骨的第一步。

材料与方法
研究设计经长庚纪念医院伦理委员会批准，所有动物程序均符合长庚纪念医院动物研究指南。

准备工作
在开始进行体内研究之前，作者精确地开发并验证了手术概念。在6只兔尸体上，作者仔细地进行并评估了必要的手术步骤，包括骨膜瓣的采集技术，在不接触软骨下骨的情况下产生纯软骨缺损，椎弓根的制备以及瓣到膝盖的旋转特别是，皮瓣在缺损上的固定技术。

动物
对于体内研究，在长庚纪念医院动物研究委员会的指导下，使用体重约2.5kg的6只3月龄新西兰兔（家畜研究所，台南，台湾）。将兔子保持在17-23℃的温度，湿度为30-80％，并且在12:12小时的循环中进行浅黑暗，自由饮水和标准食物。

手术和团体
使用Zoletil©与Rompun©（盐酸赛拉嗪23.32mg / ml）以1：1的比例进行手术并且对3.0kg兔子注射2.3ml进行手术。将Zoletil?作为冻干粉末在无菌小瓶中提供，其含有125mg的谷氨酰胺和125mg的唑拉西泮和5ml的蒸馏水。

剃去后肢后，用聚维酮碘将其擦洗至无菌状态，然后用无菌片覆盖四肢。然后，沿着内侧髌骨线和腹侧胫骨进行纵向切口。在小心止血和内侧囊的髌旁切口下制备皮下组织后，髌骨横向脱位以暴露膝关节。使用旋转研磨盘在两腿的外侧和股骨内侧髁中形成4×4mm的全厚度软骨缺损[临界尺寸缺陷国际软骨修复学会（ICRS）IV级]。注意避免软骨下骨损伤，这可以通过完全没有出血来证实，以防止可能的局部软骨从骨髓干细胞内部恢复。通过这种技术，每只动物可以实现四个缺陷。两侧内侧髁部缺损覆盖骨膜瓣，两侧外侧髁缺损未作为阴性对照（图1A）.1A）。 （牺牲后，另外收获侧髁的背侧以作为阳性对照。）


图1
手术技术。 （A）在产生内侧和外侧髁的临界尺寸软骨缺损之后的左腿。 （B）骨膜瓣与骨表面的谨慎分离。 （C）基于隐静脉动脉及其静脉通道采集骨膜瓣，可以清楚地看到骨膜的营养血管。 （D）凸起皮瓣的底面;形成层是可见的。 （E和F）内侧缺损覆盖和经骨缝合固定后的左右腿。

收集基于隐静脉动脉及其静脉通道的轴向图形胫骨骨膜瓣（图（图1B-D）1B-D）以及血管周围组织套囊（平均尺寸，5mm×15mm）。根据Chen等人的手术技术解剖蒂，他们进行了这种皮瓣设计以进行成骨检查10. 在采集骨膜皮瓣时，特别注意形成层与骨表面的精确制备和分离因为位于该层的软骨细胞前体细胞必须完全包含在皮瓣中。该技术具有自由旋转弧的优点，因此可以将翼片自由定位到缺损中（图1E1E和和F）.F。然后使用6.0 ethilon缝线以经骨缝合技术将皮瓣固定到病变部位。使用Tissucol Duo S©两种成分纤维蛋白原组织胶进一步固定，作者认为这在作者的准备工作中是有用的。皮瓣固定后，重新定位髌骨，用4-0可吸收缝合线（PDS）封闭切开的关节囊，除了包含瓣膜蒂的小三角形空间。通过关节的被动运动，确保了在任何关节位置上椎弓根上没有压缩。用4-0尼龙材料缝合浅表筋膜和皮肤。

对于术后镇痛，兔子每天接受5mg / kg的酮洛芬。术后5天注射。手术后，允许兔子在笼子里自由活动，并在膝盖完全负重的情况下锻炼腿部。

评估愈合期为4周。

安乐死和标本收集
手术后4周，进行视频辅助宏观步态分析。允许动物在具有粗糙纺织地板的3×3m场中自由移动30分钟。在10分钟的适应期后，通过宏观上的商业视频设置评估腿的使用（完全/不完整），负重（完全/限制姿势）和行走模式（谐波/蹒跚）。

之后，再次对兔子进行麻醉以进行标本采集（重要的是评估活体动物中的关节以评估椎弓根的搏动）。进行伤口外观，关节运动范围和各方向的关节稳定性，控制侧副韧带和十字韧带。

为了准备，再次打开手术部位并检查感染或液体收集的迹象。由于血液供应减少，在骨膜再生或皮质胫骨可能部分坏死方面宏观检查腹侧胫骨骨干的骨膜周围收集缺损。

关于关节，首先检查隐静脉蒂的搏动作为瓣的可行性的标志。然后，再次以相同的方式打开关节，拍摄髁表面的外观并根据皮瓣附着和宏观表面质量进行评估。视觉上可接受的修复被认为是光滑，坚固的修复组织，填补了缺陷。

然后沿前额收获两个膝盖的内侧和外侧以及背外侧股骨髁，并固定用于4％缓冲福尔马林的组织学检查。然后通过过量注射利多卡因杀死兔子。

组织学
随机选择每只兔子的膝盖进行组织学和免疫组织化学分析 - 将它们在10％硝酸中脱钙至少2周，然后根据标准方法脱水并包埋在石蜡中，然后将它们切片并加工成常规苏木精和 曙红和Movat的染色，也根据评估软骨特异性细胞外基质的标准方法。 根据ICRS量表对不同组中关节软骨缺损中的再生组织的质量进行评分（表（表1）1）.11。分别检查每个切片并评分。 根据以下方面对部分进行分级：（i）表面连续性; （ii）基质染色; （iii）再生组织与周围关节软骨的整合; （iv）软骨细胞形态; （v）软骨厚度和（vi）软骨下骨结构。

表格1
用于评估关节软骨修复的改良ICRS组织学评分量表[11]


免疫组化分析
对于IHC分析，对I型胶原和II型胶原（Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，TX，USA）染色连续切片。将石蜡包埋的切片脱石蜡，随后处理4分钟。用蛋白酶1（Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ，USA）。然后使用用TBST稀释至1：100的小鼠抗人I型胶原蛋白或山羊抗人II型胶原蛋白一抗染色切片，然后用抗小鼠或抗兔二抗进行染色。将切片暴露于二氨基苯嗪∽5分钟。切片用苏木精复染30秒。阳性反应导致棕色染色。使用Image J程序计数II型胶原染色区域。

生物力学分析
对侧膝关节（n = 6）的标本立即在新鲜条件下评估其生物力学性质。在专门准备的测试装置中（图（图2），2），对弹性和最大值（失效载荷）进行阳性对照，阴性对照以及皮瓣覆盖髁的压缩测试。 ）。


图2
用于髁突生物力学压缩测试的视频辅助测试装置。

作者使用的设备由国立台湾大学机械工程系的TiMMeL实验室建造。它由一个样品装载平台（自行构造，使用不锈钢和聚甲基丙烯酸甲酯部件），步进电机驱动平台（产品名称：SGSP20-85（X）; SIGMA KOKI Co.，Ltd.，Sumida-ku，Tokyo）构成日本），舞台控制器（产品名称：SHOT-204MS; SIGMA KOKI Co.，Ltd。），称重传感器（产品名称：LTS-200GA; Kyowa Electronic Instruments Co.，Ltd.，CHOFU-SHI，Tokyo，日本）和数据记录器/分析仪（产品名称：DBU-120 A; Kyowa Electronic Instruments Co.，Ltd。）。将样品固定在装载平台上，并由位于步进电机驱动台上的称重传感器压缩。通过级控制器，以10μm/ sec的速度控制测力传感器的位移，这与样品的变形直接相关。通过称重传感器测量力信号并由数据记录器/分析仪分析。

统计分析
使用SPSS 16.0（IBM Corp.，New York，NY，USA）统计软件通过非配对t检验分析和比较定量数据。寻求统计误差α为5％（α0.05），因此具有差异（P <0.05）的值被认为是显著的。

结果
宏观分析
在步态分析中，四只兔子表现出完全自然的行走模式，两只兔子不完全地使用一只下肢，每只都表现出缓解姿势。

所有伤口完全愈合，没有感染迹象。 12条腿中有10条出现轻微肿胀。

临床试验显示，所有12个关节在外侧和内侧方向（侧副韧带）和前 - 后方向（十字韧带）上都是稳定的。 关节在伸展和屈曲时具有全范围的运动。

在重新打开手术部位后，在所有情况下都可以注意到供体部位的完全宏观恢复，新骨组织覆盖了骨膜缺损（未进一步评估;图3A3A和DD）。


图3
愈合期4周后的宏观分析。 （A）从膝盖的内侧看，箭头表示隐静脉动脉和静脉蒂，在所有情况下均表现出强烈的脉动（以及皮瓣的营养）。 （B和C）去除髌骨后对髁突的观察，显示骨膜瓣完整和部分覆盖缺损。 （D）将骨膜瓣完全整合到缺损中的另一种情况，建立具有光滑表面的薄的新软骨层。阴性对照显示软骨恢复迹象，供体部位完全愈合。

所有12个椎弓根均显示出强烈且规则的脉动，作为灌注和皮瓣存活的第一个迹象（图3A）.3A）。对于标本采集，后来必须解剖椎弓根并且可以检测到来自隐静脉血管的强烈脉动性出血。

在五个关节中，作者可以检测到略微侧向脱位的髌腱;在七个关节中，髌腱仍处于正确位置。

在移除髌骨后，可以评估皮瓣附着。五个皮瓣是稳定的并且完全附着在缺损表面上，并且七个皮瓣显示出部分附着（6×50％覆盖，1×30％覆盖;图3B3B-D）。

组织学评价
根据ICRS量表（表（表1）1）11，阳性对照通过光滑连续的表面，透明基质，柱状簇和正常软骨下骨进行表征，这是健康关节软骨的典型征象（图（图4a）.4A）。阴性对照仍显示软骨缺损，没有软骨恢复迹象。软骨下骨表面刚被纤维组织薄层覆盖（图4B4B）。


图4
组织学评价。 （A）阳性对照，苏木精和伊红染色，4×。 （B）阴性对照，HE，4×。 （C）由骨膜瓣（Movat染色）构建的新软骨。 （D）附着区中新软骨的透明基质和柱状细胞分布（Movat染色）。 （E）整合骨膜瓣（右侧部分），稳定覆盖骨表面和周围原始软骨（左侧部分），注意皮瓣的光滑表面。 HE 4×。 （F）专注于已经改变为新软骨（右）到骨表面（左）的皮瓣的稳定附着。 HE 10×。 （G）一些骨膜瓣的混合成分。皮瓣显示出对软骨下骨的强烈附着（右）。它由在其基部新近形成的软骨组成，靠近骨头，并且仍然是具有光滑规则表面的覆盖纤维层。在这两者之间，可以注意到一个新建的骨组织的小岛。 HE 10×。

六个皮瓣覆盖的股骨内侧髁的组织学评估揭示了以下内容：关于软骨厚度，在所有情况下都高于周围的原始软骨。在五个膝盖中，它比正常软骨的2/3厚，并且在一个膝盖中，它比正常软骨厚2/3（图（图4C）.4C）。组织由软骨基质组成，靠近骨表面，仍然被纤维基质覆盖（图4C4C和G）.G）。三个表面光滑，另外三个表面光滑，不规则。将皮瓣组织整合到骨表面中有三种情况完成（图（图4E）4E），并且在三种情况下仅部分完成。在六种情况下，基质由透明/纤维混合组织组成，显示了柱状簇的软骨典型细胞分布（图4D，4D，EE和G）.G）。在三种情况下，在组织切片中可以发现新形成的骨组织的小岛（图（图4G）.4G）。下方软骨下骨显示出一些恢复体征，没有骨折，坏死或愈伤组织形成的迹象。

免疫组化
I型和II型胶原的免疫染色显示切片的组织亚型的特异性染色模式（图5（表5.5），表2）.2）。阳性对照的正常关节软骨（以及阴性对照的边界）以及骨膜瓣的新软骨对于I型胶原染色较弱，但对于II型胶原染色较强。 I型胶原蛋白更多地位于相邻的骨组织中并且强烈地染色骨膜瓣的纤维组织和阴性对照上的薄层（图5，表表22）。

表2
用胶原蛋白I和胶原蛋白II对阴性对照组，阳性对照组和纤维组织的不同组织类型进行免疫化学染色的总结

原始软骨以及新软骨对于Coll II显示出特征性阳性结果，但对于Coll I则没有，其在骨中轻微表达并且在纤维组织中强烈（nm：不可测量，因为没有纤维组织位于 积极的控制部分）。 请参见图片（图（图55））。


图5
IHC染色与Coll I（上排，A-C）和Coll II（下排，D-F）阴性对照（A和D）的相应部分，阳性对照（B和E）和覆盖有骨膜瓣的髁（ C和F）。 Coll I染色主要存在于纤维组织（例如骨膜瓣）和骨表面（例如阴性对照中的游离软骨下骨）中，但不是典型的软骨中。阳性对照的原始软骨以及新软骨显示出Coll II的特征性阳性结果。

生物力学测试
生物力学压缩测试的结果如图6.6所示。计算的起点是“软骨（应力 - 应变曲线）”图，其中一个示例性地显示在图6A6A中。曲线的左侧部分显示出几乎线性的关系，呈现弹性（通过直线的上升梯度或斜率计算），其中很小的应力导致更高的材料变形。曲线的左侧更弯曲部分表示更高阻力的区域，其中增加的应力导致更小的变形。变形的极限可以在曲线末端的急剧下降（最大值）中看出。


图6
生物力学压缩测试。 （A）示例性软骨（应力 - 应变曲线）图，呈现曲线的右线性部分中的弹性，更弯曲部分中的更高电阻的面积和左边的曲线急剧下降时的最大负荷。 （B）三组的弹性（N / m 2）图。 （C）最大载荷图（MPa）。 （SPSS 16.0统计软件，单向anova和post hocTukey检验（P <0.05被认为是显著的）。对于B和C：L =外侧髁，阴性对照，M =内侧髁，新软骨，P =背侧髁突，阳性对照。

新软骨组（M）的平均弹性低于阳性对照组（P）的完整软骨的平均弹性。阴性对照组（L）的弹性在两组之间。最大值，即变形的终点，在阴性对照组的纯骨组织中最高，在阳性对照组的正常软骨中最低，其中新软骨组在其中。 P和L之间以及P和M之间的差异是显著的（图6B和B）。

讨论
通过这项研究，作者打算结合组织工程的知识和整形外科领域的经验来解决骨关节炎的创伤和骨科疾病。

已经有几种努力使用各种模型来关于骨膜组织这一有前途的软骨工程领域，但是在最近的科学领域和医学文献中缺少一个方面。一方面，有几种使用细胞培养或不同生物反应器6,12-14的体外模型用于骨膜软骨细胞的增殖。另一方面，存在具有不同组织转移设计的多种体内模型。所有这些都与免费的非血管化骨膜转移有关，总是导致缺损的不完全填充和纤维组织的存在而不是透明软骨9.由于转移组织的充足营养是必不可少的前提条件，在骨膜组织的情况下可能不只有通过滑液发生，作者才考虑通过血液供应营养皮瓣模型来进行关节软骨修复研究的必要下一步。

因此，在这种“平移”方法中，作者首次在医学文献中评估血管化的骨膜瓣作为“独立的”生物材料，其具有自身的血液供应以重建膝盖的外侧软骨缺损。

作为作者研究的第一个也是有希望的结果，作者可以假设这个假设是正确的。如结果部分所述，所有皮瓣蒂在实验的终点显示出强烈的脉动，作为灌注皮瓣的灌注和稳定营养的标志。所有皮瓣均存活，无任何坏死或细胞死亡迹象;没有发现任何人体组织或感染。另外，形成新形成的软骨组织，填充所产生的软骨缺损。因此，通过专用蒂维持转移的骨膜的独立血液供应可能是体内软骨工程化的里程碑。

在下文中，作者希望深入了解所使用模型的细节和作者的发现：

骨膜由两个不连续的层组成：内层形成层含有未分化的MSCs 15和软骨细胞前体细胞和外层纤维层（图7）.7）。形成层通过并置区域连接到骨表面，并通过并置纤维区域连接到纤维层1. 体外和体内实验证明软骨形成源自骨膜，并发现这种软骨形成和软骨形成始于形成层的近邻区域和新软骨生长是并置的，远离纤维层1.在软骨形成过程中，纤维层持续存在，而新软骨从近似区域进展到形成层的近似纤维区域并逐渐取代它。在作者的结果中，作者可以强调这些发现。在4周的观察时间内建立新的软骨，并且发现新的软骨位于与骨的附着区域中的瓣的基部，其由形成层的近邻区域表示。纤维层持续并覆盖具有光滑表面的新软骨（图4）.4）。其特征在于与软骨组织相比I型胶原的强烈表达，其显示没有I型胶原染色（图5，表表22）。


图7
骨膜的组成及其纤维和形成层。软骨形成活性在形成层的近邻区域开始并且进展到形成层中的近似纤维区域。再生的新软骨的生长是定向的，远离纤维层。

关于骨膜软骨形成事件的时间过程，Miura等。基于研究涉及培养6周的2个月大的兔子的850个骨膜外植体，确定了表征软骨形成的事件的一般序列和时间过程.16。作为第一个事件的增殖（3H-胸苷掺入）是最大的第3天并且在第10天降至基线。基质合成通过聚集蛋白聚糖表达在第3-7天开始上升，II型胶原蛋白表达在第7-10天上升，并且35S-硫酸盐掺入在第1天开始上升。 10.在第21天，达到聚集蛋白聚糖（六倍），II型胶原蛋白表达（200倍）和3H-胸苷摄取的表达峰。 14天后，II型胶原蛋白含量增加至平台42天。软骨形成的组织学证据在第14天开始并在第28-42天达到平台期。 TGF-β1刺激的外植体湿重增加3个月。目前的作者假设新软骨细胞的发育和成熟发生在这三个连续阶段，这些阶段由过渡限制点区分，并由生长因子（可能是机械或其他因素）分别调节。在这些结果的基础上，作者评估了作者研究中的观察时间为28天，以确保找到新软骨组织的组织学证据。作者的研究结果与所描述的时间过程完全一致，28天后发现组织学上可见的软骨形成，尽管作者当然仅在整个愈合期的第4周评估该单个时间点。在进一步的研究中，作者计划在长达8周的时间内检查软骨生长，以评估整个骨膜瓣，包括纤维层是否将完全被新形成的软骨取代的问题。

必须考虑的是，生物力学因素可能会影响骨膜软骨形成。大量研究表明，有或没有骨膜移植物的兔关节软骨修复随着术后连续被动运动的使用而改善2,17-19。可能的解释可能涉及关节内静水压力（动态流体压力），直接机械压缩，流体流动和营养效应或剪切力的振荡。由于关节内压力的周期性振荡，连续被动运动有助于快速清除关节僵硬症。同样为了将骨膜MSC和前体细胞分化成软骨细胞，作者认为这种高度特异性的条件是典型的“靶组织”（如关节软骨的生物力学活性）必不可少的。这就是为什么作者允许动物自由移动和重量承受他们的关节。

结果还表明，利用开发的外科技术，可以将皮瓣充分固定到缺损上。尽管有观察到皮瓣部分附着在骨上的情况，这可能是由于细胞水平上的不完全整合和观察时间太短，但是通过关节运动没有发现皮瓣脱位。当然，正如O'Driscoll等人的研究所示。和鲁巴克等人。在图2,20中，骨膜移植物所处的缺陷深度是重要的。缺陷必须足够深，以防止在细胞外基质沉积之前通过相对的关节表面压缩移植物表面;并允许新软骨生长，使其不受不合理的力量影响。支持手术技术可行性的另一个方面是所有关节都是稳定的（侧副韧带和十字韧带）并且具有全范围的运动。除了两只用一条腿轻微“蹒跚”的兔子外，这些动物通常使用它们的腿，没有疼痛限制。阴性对照的缺陷另外没有显示软骨恢复的迹象，它们仅被薄层的I型胶原阳性纤维组织覆盖。这证明它们的尺寸足够大（临界尺寸）并且软骨形成不受软骨下组织的支撑。

关注作者的组织学结果，需要讨论几个方面。首先，如已经提到的，在形成层的近邻区域中发现了新形成的软骨组织。根据ICRS 11的评分，这是由透明基质和柱状细胞分布组成的特征性和健康的软骨组织。 IHC染色结果强调了这些发现，具有I型胶原的弱染色的特征分布，但是软骨的II型胶原染色强烈。在评估的4周愈合时间点，骨膜瓣未被新软骨完全取代。软骨仍然被纤维层覆盖。此外，整个复合材料比周围的正常软骨厚2/3。在进一步的长期实验中，作者计划观察进一步的变化。

另一个重要发现是骨膜能够牢固地附着在软骨下骨上，但是在某些情况下它仅部分附着。一方面，这再次支持了经骨缝线和组织胶固定的手术技术的可行性。另一方面，它表明尽管完全负重和自由运动，移植物在细胞水平上的完全整合是可能的。

关于手术固定技术，作者认为组织胶的作用是特殊的。已知使用的纤维蛋白密封剂TissueCol&#174;等粘合剂可提供比固定更多的益处和增强组织愈合，包括改善的生物相容性，再吸收性和非免疫原性21.作为生物活性剂，它能够支持软骨细胞再生的软骨再生22和它们分泌的细胞外基质23被描述为用于关节软骨组织工程本身的有前景的生物材料。在作者的研究中，作者将纤维蛋白胶用于固定和生物活性剂，但胶水对作者的结果的确切贡献必须在进一步的研究中得到解决（参见研究的局限性）。

此外，在一些标本中，在新软骨和骨膜瓣的纤维层之间发现了小的骨组织岛。这可能是因为一些MSC分化为成骨细胞。当然，骨膜也是骨生长支持和骨重建24,10和分化为成骨细胞的广泛使用和众所周知的模型。在设计作者的研究时，作者假设骨膜干细胞总是分化为围绕它们的特定条件的方向，将检测关节典型因素，如滑液和生长因子，压缩和滑动负荷以区分为软骨。主要是软骨形成的事实支持了作者的假设。对于接下来的研究，作者的目标是更详细地研究这种骨形成（特别是关注长期观察）。

生物力学结果反映了作者的组织学发现。对照组正常软骨的弹性最高，而新软骨组的弹性最低，甚至低于阴性对照组。这可以通过骨膜瓣非常异质的组织来解释。最多只有三分之一的皮瓣由软骨组织组成。这可能是因为同时存在的具有不同生物力学特性的骨岛和纤维组织。最大值显示更清晰和全面的结果。它在阴性对照的纯骨组织中最高，在阳性对照组的正常软骨中显著低。骨膜瓣组的混合组合物导致两者之间的值，显著高于阳性对照。

当然，作者的研究有其局限性，是一项试验性研究，总共仅与6只兔子一起工作。虽然作者设计了阳性对照和阴性对照，但是与一组游离的非血管化皮瓣进行比较将完成设计。此外，必须进一步解决用于皮瓣固定和附着的用过的组织胶的作用;不使用组织胶的对照组将是有用的。此外，需要更多的动物才能获得统计学上有效的结果。如前所述，作者的下一步将是一项长期研究，评估骨膜瓣在至少8周后的变化。

在本研究中，作者想首次检查血管化骨膜瓣的手术技术及其可行性。对于这个试验性实验，作者使用了3个月大的幼小动物，这些动物当然不代表可能患有局部骨关节炎的老年患者。只有外翻创伤性软骨缺损可以通过该模型表示。已知软骨细胞前体细胞的总密度和体积随着年龄和不同的供体部位而变化8，因此使用较老的动物将是另一个重要步骤。

总之，这项研究表明血管化的骨膜瓣能够产生软骨。似乎可以重建外皮软骨缺损。虽然这些是初步研究的结果，但作者相信，这种技术可以具有广泛的潜在应用，例如天然衍生生物材料，软骨组织工程以及再生医学的开发。

参考：
The vascularized periosteum flap as novel tissue engineering model for repair of cartilage defects
Ito Y, Fitzsimmons JS, Sanyal A, et al. Localization of chondrocyte precursors in periosteum. Osteoarthritis Cartilage. 2001;9:215–23. [PubMed] [Google Scholar]
O'Driscoll SW, Keeley FW, Salter RB. The chondrogenic potential of free autogenous periosteal grafts for biological resurfacing of major full-thickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion. An experimental investigation in the rabbit. J Bone Joint Surg Am. 1986;68:1017–35. [PubMed] [Google Scholar]
Gallay SH, Miura Y, Commisso CN, et al. Relationship of donor site to chondrogenic potential of periosteum in vitro. J Orthop Res. 1994;12:515–25. [PubMed] [Google Scholar]
Iwasaki M, Nakahara H, Nakata K, et al. Regulation of proliferation and osteochondrogenic differentiation of periosteum-derived cells by transforming growth factor- and basic fibroblast growth factor. J Bone Joint Surg Am. 1995;77:543–54. [PubMed] [Google Scholar]
Nakahara H, Bruder SP, Goldberg VM, et al. In vivo osteochondrogeneic potential of cultured cells derived from periosteum. Clin Orthop. 1990;259:223–32. [PubMed] [Google Scholar]
Tarng YW, O'Driscoll SW, Reinholz GG, et al. Directional fluid flow enhances in vitro periosteal tissue growth and chondrogenesis on poly-e-caprolactone scaffolds. J Biomed Mater Res. 2010;95:156–63. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Ivkovic A, Pascher A, Hudetz D, et al. Articular cartilage repair by genetically modified bone marrow aspirate in sheep. Gene Ther. 2010;17:779–89. [PubMed] [Google Scholar]
O'Driscoll SW, Fitzsimmons JS. The role of periosteum in cartilage repair. Clin Orthop. 2001;391:190–207. [PubMed] [Google Scholar]
Aroen A, Heir S, Loken S, et al. Healing of articular cartilage defects. An experimental study of vascular and minimal vascular environment. J Orthop Res. 2006;94:1069–77. [PubMed] [Google Scholar]
Chen ACY, Lin SS, Chan YS, et al. Osteogenesis of prefabricated vascularized periosteal graft in rabbits. J Trauma. 2009;67:165–7. [PubMed] [Google Scholar]
Rutgers M, van Pelt MJ, Dhert WJ, et al. Evaluation of histological scoring systems for tissue-engineered, repaired and osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 2010;18:12–23. [PubMed] [Google Scholar]
Saris DB, Fitzsimmons JS, O'Driscoll SW, et al. Periosteum responds to dynamic fluid pressure by proliferating in vitro. J Orthop Res. 1999;17:668–77. [PubMed] [Google Scholar]
Mukherjee N, An KN, O'Driscoll SW, et al. The enhancement of periosteal chondrogenesis in organ culture by dynamic fluid pressure. J Orthop Res. 2001;19:524–30. [PubMed] [Google Scholar]
Tarng YW, Huang BF, Su FC. A novel recirculating flow-perfusion bioreactor for periosteal chondrogenesis. Int Orthop. 2012;36:863–8. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Tonna EA, Cronkite EP. Autoradiographic studies of cell proliferation in the periosteum of intact and fractured femora of mice utilizing DNA labeling with 3H-Thymidine. Proc Soc Exp Biol Med. 1960;107:720–1. [PubMed] [Google Scholar]
Miura Y, O'Driscoll SW. General time course of periosteal chondrogenesis in vitro with TGF-1. Orthop Trans. 1994;18:686. [Google Scholar]
O'Driscoll SW, Keeley FW, Salter RB. Durability of regenerated articular cartilage produced by free autogenous periosteal grafts in major full-thickness defects in joint surfaces under the influence of continuous passive motion: a follow-up report at one year. J Bone Joint Surg. 1988;70:595–606. [PubMed] [Google Scholar]
Delaney JP, O'Driscoll SW, Salter RB. Neochondrogenesis in free intra-articular periosteal autografts in the complete absence of motion: an experimental investigation in the rabbit. Clin Orthop. 1989;248:278–82. [PubMed] [Google Scholar]
Alfredson H, Lorentzon R. Superior results with continuous passive motion compared to active motion after periosteal transplantation: a retrospective study of human patella cartilage defect treatment. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 1999;7:232–8. [PubMed] [Google Scholar]
Rubak JM, Poussa M, Ritsil&#228; V. Chondrogenesis in repair of articular cartilage defects by free periosteal grafts in rabbits. Acta Orthop Scand. 1982;53:181–6. [PubMed] [Google Scholar]
Shah NV, Meislin R. Current state and use of biological adhesives in orthopedic surgery. Orthopedics. 2013;36:945–56. [PubMed] [Google Scholar]
Deponti D, Di Giancamillo A, Gervaso F, et al. Collagen scaffold for cartilage tissue engineering: the benefit of fibrin glue and the proper culture time in an infant cartilage model. Tissue Eng Part A. 2014;20:1113–26. [PubMed] [Google Scholar]
Chou CH, Cheng WT, Kuo TF, et al. Fibrin glue mixed with gelatin/hyaluronic acid/chondroitin-6-sulfate tri-copolymer for articular cartilage tissue engineering: the results of real-time polymerase chain reaction. J Biomed Mater Res A. 2007;82:757–67. [PubMed] [Google Scholar]
Ortak T, Ozdemir R, Uysal A, et al. Osteogenic capacities of periost grafts, periost flaps and prefabricated periosteal flaps: experimental study. J Craniofac Surg. 2005;16:594–600. [PubMed] [Google Scholar]