在非热大气等离子体处理的手术缝合线上预防细菌定植，以控制和预防手术部位感染

概要
手术部位感染对发病率，住院时间和死亡率都有显著影响。缝合线有助于手术部位感染的发展，因为它们被认为是人体中的异物。缝合线作为微生物粘附和随后的定植，生物膜形成和手术部位感染的优异表面。已经开发了各种抗微生物缝合线以防止缝线介导的手术部位感染。然而，取决于手术部位，抗微生物缝合线可能仍然无效，并且抗微生物剂可能具有缺点。等离子体被定义为由电离气体，活性氧和氮物种，自由基和中性物质组成的第四种物质状态，由于其优异的抗菌活性，引起了对医院获得性感染的控制和预防的关注。在本研究中，研究了非热大气等离子体治疗预防手术部位感染的功效。首先，用非热大气等离子体处理受污染的聚（乙醇酸 - 共 - 乳酸），聚乙醇酸，聚二恶烷酮和聚（乙醇酸 - 共 - 己内酯）缝合线，以根除诸如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的污染细菌。此外，缝合线用非热大气等离子体预处理，然后暴露于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。作者的研究结果表明，非热大气等离子体处理有效地消除了缝合线上的污染细菌，非热大气等离子体预处理有效地防止了缝合线上的细菌定植而不改变其机械性能。用FT-IR和XPS进行缝合线的化学表征，结果表明，非热大气等离子体处理显著增加了缝合线的亲水性，这可能是预防细菌定植的主要机制。总之，经等离子体处理的缝线可被视为控制和预防手术部位感染的新型替代材料。

介绍
手术部位感染（SSI）是医院获得性感染（HAI）中最常见的，其发病率可能上升至25％，具体取决于手术部位的解剖位置[1]。 SSI不仅会增加死亡率和发病率，还会对医疗保健成本产生显著影响，每位患者额外需要9.7天住院治疗和额外经济负担25.000美元[2-4]。

尽管医疗技术迅速而且大量增加，但手术仍然是现代医学不可避免的一部分。尽管引入了新的手术切口闭合方法，如外科缝合钉，缝合术仍然是手术切口闭合的最常用方法，自从它们首次使用以来可以追溯​​到公元前3500年，并形成手术过程中不变的部分[5- 8]。手术缝合线是一种细丝形医疗装置，它将伤口的开口端保持在一起并且必须承受正常水平的生理机械应力，以便为伤口闭合提供足够的机械支撑[8]。缝合线可根据其生物降解性分为可吸收或不可吸收的类别，根据其线型可分为单丝或复丝（或编织）[9]。

缝合在闭合手术伤口中起着至关重要的作用。然而，类似于植入体内的其他医疗装置，缝合线是伤口部位上的异物并且充当细菌附着的病灶。因此，缝合线的存在显著增加了伤口对感染的易感性，并随后增加了手术部位感染的风险[10,11]。伤口部位缝线的存在使感染风险增加约10,000倍[12]。虽然能够在开放性伤口上引起感染的细菌数量是每克组织约105个菌落形成单位（CFU），但当缝合线用于闭合时，该数量急剧下降至约102CFU /每克组织。伤口[13]。此外，当它们在缝合线表面定植时，细菌的抗生素敏感性大大降低[11]。手术伤口部位的感染不仅会危害所需的伤口愈合过程，还可能演变成危及生命的疾病，特别是在重症患者中[12,14]。与其他植入式医疗器械相关的感染类似，生物膜形成是缝线相关SSI发病机制的关键过程[2,15]。

手术缝合线上的生物膜形成是一个复杂的过程，其始于病原体在缝合材料上的粘附。在将缝合线植入手术伤口后的最初4-6小时内的细菌粘附对于生物膜形成和缝线相关SSI的发展是至关重要的[10,16]。此外，作为生物膜形成的一部分，异物上的初始细菌粘附被报道为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最重要的毒力因子[17,18]。因此，在植入手术缝合线后不久，防止初始细菌粘附和/或易粘附细菌的失活被认为是预防缝合线相关SSI的关键尝试。

除了病原体的毒力因子外，缝合材料的物理性质和化学成分对细菌粘附也是相互关联的[19-21]。

开发了三氯生涂层抗菌缝合线，并广泛用于防止缝线表面上的细菌粘附，以预防手术部位感染[12]。三氯生是一种有效的抗菌药物，其对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体均有效[3]。各种作者报道了三氯生涂层缝线预防SSI的抗菌效果和成功的临床表现[11,22]。然而，可以从三氯生涂层缝合线获得的临床益处高度依赖于手术的类型和解剖部位。虽然在胸骨手术，腹壁闭合和脑脊液分流手术中使用三氯生涂层缝线的结果对于预防SSI是令人满意的，但在阑尾炎，乳腺癌和结肠直肠手术后预防SSI方面没有显著改善[1] 。在抗菌缝合线中广泛使用三氯生及其在肥皂中的不必要用途通过各种机制导致细菌耐药性的发展，包括外排泵和降解酶的过度表达[23]。此外，报道了三氯生在人乳，脐带血，脂肪组织和尿液中的生物累积。三氯生在人体内的生物累积与免疫，内分泌和生殖系统可能产生的不良影响有关[24]。

已经考虑了具有抗微生物活性的金属物质如银，以开发抗微生物缝合线以与SSI作斗争。然而，地形依赖性的细菌粘附预防和与银的理想组织相容性尚未完全了解和证实[10]。

类似地，由于其广谱和有效的抗微生物活性，氯己定涂覆的缝合线可以作为预防SSI的替代方案。然而，短期持久的抗菌作用和氯己定的生物相容性受限，可能会限制氯己定涂层缝合线预防SSI的临床效果[1]。因此，仍然需要一种能够防止病原体初始粘附到缝合线表面以防止缝线相关SSI的新型有效缝合线。

等离子体被定义为物质和电离气体的第四种状态。通过向气体施加外部电场可以人为地产生等离子体。当外部电场施加到一定体积的气体时，自由电子在施加的电场的作用下被加速，以获得更高的动能。然后，加速的自由电子与气体原子和/或分子碰撞，并导致从气体分子中去除电子（从气体分子中除去的电子称为二次电子），导致气体电离和等离子体的形成[25,26]。取决于气体的温度，等离子体被分类为热等离子体和非热等离子体。在非热等离子体中，自由电子可能达到几千开尔文，而环境气体则保持在室温下。因此，非热等离子体可用于生物医学应用和热敏材料的处理[27]。

非热等离子体的生物医学效应主要归因于等离子体形成过程中产生的自由基，活性氧（ROS），活性氮物种（RNS），自由电子，紫外（UV）光子和电场[28] ]。

非热大气等离子体（NTAP）对浮游生物和生物膜形式的病原体（包括多重耐药菌株）的优异和广谱抗菌作用已得到充分证明[29-31]。 NTAP本身不仅显示抗微生物活性，而且还显示诸如液体（即去离子水，磷酸盐缓冲盐水溶液），凝胶和超声造影剂之类的材料。甚至金属表面在用NTAP处理时也具有抗菌活性[28,32-37]。例如，在作者之前的一项研究中，作者使用类似的NTAP设置处理藻酸盐凝胶，并证明藻酸盐凝胶可以获得抗菌活性[35]。同样，在NTAP处理普通植入材料后，这些材料的生物膜形成明显减少[37]。在另一项研究中，Yorsaeng等人。表明乳胶手术手套可通过冷等离子体处理获得抗菌活性[38]。在本研究中，据作者所知，文献中第一次使用NTAP治疗来获得能够预防细菌粘连以防止缝合相关SSI的缝合线。

在本研究中，两条编织复丝缝合线;聚（乙醇酸 - 共 - 乳酸）（PGLA），（聚乙醇酸）PGA和两根单丝缝合线; （聚二恶烷酮）PDO，聚（乙醇酸 - 共 - 己内酯）PGCL用NTAP处理以预防缝线相关的SSI。在大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）上测试NTAP处理的缝合线的活性。此外，在污染的缝合线样品上测试NTAP的微生物灭活功效，以根除已经粘附的病原体。此外，评估了NTAP处理对缝合线的机械性能，降解和表面性质的影响。使用FTIR和XPS表征取决于NTAP的可能的化学修饰。还研究了NTAP处理的缝合线对体外伤口愈合的影响。

材料和方法
缝合线样品的制备及等离子体处理
在本研究中，无菌，可吸收，美国药典（USP）1号，两条编织复丝缝合; PGLA，PGA和两根单丝缝线;使用PDO，PGCL。另外，含有氯己定二乙酸酯作为抗微生物剂的抗菌PGLA（ALCALACTINE）缝合线样品用作定殖实验中的阳性对照。所有缝合样品均由KATSAN A.S（土耳其伊兹密尔）慷慨捐赠。

将定制的介质阻挡放电（DBD）电极连接到微秒脉冲交流（AC）电源以产生非热大气DBD空气等离子体（Advanced Plasma Solutions，Malvern，PA，USA）。通过用1mm厚的载玻片（50mm×75mm）覆盖10mm厚的铜板（38mm×64mm）来构造DBD电极。将剩余的铜板置于聚乙烯外壳内以使暴露的表面绝缘。对于所有实验，电源在32kV峰峰值电压，2.5kHz频率和10μs脉冲持续时间下操作，其产生0.65W / cm 2的功率密度。放电间隙固定为1mm。

通过将高压灭菌带放置在缝合线两端7mm距离处切割约7.5cm长的缝合线段并固定在1mm厚的载玻片上，以使缝合线样品完全暴露于等离子体放电（图1）。 在等离子体处理完成后，用剪刀除去完全暴露于等离子体放电的5cm缝合线碎片。 在所有实验中，除去污测试外，样品处理7分钟。 在去污实验中，进行等离子体处理3分钟。 在微生物学实验中，大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923分别用作革兰氏阴性和革兰氏阳性模型生物。


图.1
缝线的NTAP治疗设置示意图。
图解说明NTAP处理缝合线片段的示意图。注意，使用胶带将缝合线固定在接地电极上的玻璃载玻片上，并且在完成NTAP处理后除去留在胶带下面的部分缝合线碎片。

缝合线去污
在去污染实验中，首先通过将缝合线碎片悬浮在105CFU / ml微生物悬浮液中并分别用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌污染缝合线，并在37℃下在静止培养箱中孵育12小时以允许病原体定植。孵育后，缝合线用1X无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液洗涤一次，并在32kV峰峰值电压，2.5kHz频率和10μs脉冲持续时间下暴露于NTAP处理3分钟，产生0.65W / cm 2。功率密度。根据先前用大肠杆菌对PGLA缝线进行的初步研究，确定了缝合线去污的3分钟等离子体处理时间（S1图）。

在等离子体处理后，将缝合线样品置于胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂（TSA）培养皿上，并在37℃下在固定培养箱中孵育24小时，以目测评估微生物生长。此外，通过菌落计数测定法定量NTAP的去污效力。为此目的，用NTAP类似地处理污染的缝合线样品3分钟，以类似方式用1X无菌PBS溶液洗涤，然后置于含有1X无菌PBS的微量离心管中。摇动微量离心管并充分涡旋以使PBS溶液中的病原体均质化。然后，适当地进行连续稀释，并将样品涂布在TSA培养皿上。将培养皿在37℃下在静止培养箱中温育24小时，第二天，计数存活的菌落。未处理的缝合线样品用作阴性对照。结果列举为log10（N）细菌/ cm缝合线。

预防缝线细菌定植
进行定殖实验以评估NTAP处理在手术缝合线上预防微生物定植的功效。与去污实验相反，缝合线样品首先用NTAP处理，然后置于定植实验中的微生物悬浮液中。

详细地，缝合线碎片首先用NTAP在32kV峰峰值电压，2.5kHz频率和10μs脉冲持续时间下处理7分钟，产生0.65W / cm 2的功率密度。根据先前用大肠杆菌对PGLA缝线进行的初步研究，确定了用于预防缝合线上细菌定植的7分钟血浆治疗时间（S2图）。然后，将NTAP处理的缝合线片分别置于105CFU / ml大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的微生物悬浮液中，并在37℃下在静止培养箱中孵育12小时，以允许病原体定植。孵育期后，用1X无菌PBS溶液轻轻洗涤缝合线样品以除去非粘附病原体，然后置于TSA培养皿上并在37℃下在固定培养箱中孵育24小时，目测评估微生物生长。

此外，通过菌落计数测定法定量通过NTAP处理预防细菌定植功效。为此目的，将缝合线样品用NTAP类似地处理7分钟，然后分别置于105CFU / ml大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的微生物悬浮液中，并在37℃下在固定培养箱中孵育12小时，以允许病原体的定植。孵育后，将样品用1X无菌PBS轻轻洗涤一次，并置于含有1X无菌PBS的微量离心管中。摇动微量离心管并充分涡旋以使PBS溶液中的病原体均质化。然后，适当地进行连续稀释，并将样品涂布在TSA培养皿上，然后将其在37℃下在固定培养箱中孵育24小时。第二天，对存活的菌落进行计数。未处理的缝合线样品和ALCALATINE缝合线分别用作阴性和阳性对照。结果列举为log10（N）细菌/ cm缝合线。

此外，评估了NTAP治疗的持续性，其介导了缝合线上细菌定植的预防。制备缝合线样品并以与所述类似的方式用NTAP处理。在等离子体处理后，将缝合线在室温下保持在密封的无菌培养皿中1,3,5,7和10天。在储存期结束后，将缝合线置于细菌悬浮液中，然后如所述目测和定量评估缝合线上的细菌定植。

接触角测量
使用测角仪（KSV Attension Theta，Biolin Scientific，Stockholm，Sweden）分析NTAP处理对缝合线样品亲水性的影响。对于接触角测量，通过缠绕1mm厚的载玻片制备每种缝合材料的3个重复，包括NTAP处理和未处理，以获得放置水滴的表面。如上所述，将包裹在载玻片周围的缝合线用NTAP处理7分钟。在NTAP处理后不久进行接触角测量。在未处理和NTAP处理的缝合线样品上将4μl蒸馏水滴分配到三个不同的随机位置。因此，总共对每种NTAP处理和未处理的缝合材料进行了9次不同的测量。通过测角仪系统提供的软件分析每个水滴。接触角作为每个缝合线样品的所有测量值的平均值给出。

缝合线的退化
通过降解试验评估NTAP处理对缝合线降解性能的影响。将所有类型的缝合线切成5cm的片段，并如所述用NTAP处理7分钟。在NTAP处理后，使用分析天平测量每个缝合线样品的重量。在重量测量后，将NTAP处理的缝合线样品置于10ml的1X无菌PBS溶液中，并在整个降解测试中在摇床培养箱中在37℃和120转/分钟（rpm）下孵育。每五天使用分析量表测量缝合线的重量，直到样品在处理重量测量时分解。每次测量后，刷新PBS溶液。在测量重量之前，将缝合线样品从1X PBS溶液中取出，并置于滤纸上以除去多余的液体，然后转移并在真空下保持在干燥器中，以完全干燥2小时。在干燥程序之后，使用分析规模称重缝合线样品并将其放回新鲜的1X无菌PBS溶液中。结果表示为体重变化百分比。

缝合线的拉伸测试
使用通用机械试验机（Shimadzu AGS-X 50kN，Kyoto，Japan）评价缝合线样品的机械性能。如所述将缝合线样品处理7分钟。未处理的缝合线样品用作对照。将未处理和NTAP处理的缝合线样品分别放置在试验机的拉伸臂之间。以300mm /分钟的十字头速度进行拉伸试验，拉伸5cm长的样品直至发生破裂，并以牛顿（N）记录最大载荷。

体外划痕伤口测定
通过使用L929小鼠成纤维细胞系的体外划痕伤口测定来评估NTAP处理的缝合线对伤口愈合的影响。首先，如所描述的，用NTAP处理缝合线7分钟。将未经处理或NTAP处理的研究中使用的缝合线在1ml无血清Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）细胞培养基中预孵育，同时以120rpm搅拌24小时。将L929细胞以每孔1×10 5个细胞/ ml的密度接种在6孔板上，并在补充有10％胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany），1％L-谷氨酰胺的DMEM培养基中孵育（ Genaxxon BioScinece，Ulm，Germany）和1％青霉素/链霉素（Genaxxon BioScinece，Ulm，Germany）在37℃和5％CO 2环境下。将细胞保持在指数期并在第3代使用。当细胞接近汇合时，使用无菌的200μl移液管尖端在每个孔上进行划痕以模拟伤口，并且不久之后，用倒置显微镜（Olympus CKX41，Tokyo，Japan）使伤口区域可视化。在刮擦过程中要小心，以确保为所有样品产生类似的尺寸和距离。然后，除去DMEM培养基，并使用1X无菌PBS轻轻洗涤所有孔以从划痕中除去细胞碎片。将未处理和NTAP处理的缝合线样品温育的无血清DMEM培养基转移到划痕细胞上，将其在37℃和5％CO 2环境下孵育。

在将细胞暴露于来自缝合线样品温育的无血清培养基中后1,2和3天，用倒置显微镜（Olympus CKX41，Tokyo，Japan）显现伤口区域。此外，使用其中未孵育样品的无血清DMEM作为确定伤口愈合的背景。

此外，使用Image J软件对倒置显微镜收集的图像定量NTAP处理的缝合线的伤口愈合效果。第0天的伤口面积设定为100％，第1,2和3天的伤口面积相应地归一化。

扫描电子显微镜（SEM）成像
使用Carl Zeiss 300VP扫描电子显微镜（SEM）（Zeiss，Ober4kochen，Germany）使未处理和NTAP处理的缝合线样品可视化，以研究NTAP处理对缝合线样品可能的破坏性影响。如实验组所述，NTAP处理进行7分钟。在用金（QUORUM; Q150 RES; East Sussex; United Kingdom）涂覆20mA 60秒后，在5kV的加速电压下收集SEM图像，得到约2nm厚的金涂层。

傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析
使用配备有4cm -1光谱分辨率的Thermo Scientific Nicolet iS5光谱仪获得每种类型的未处理和7分钟NTAP处理的缝合线样品的傅里叶变换红外（FTIR）光谱。该仪器配备了具有金刚石晶体的iD5衰减全反射（ATR）附件，在400-4000cm-1中收集16次扫描。

X射线光电子能谱（XPS）分析
使用配备有在1486.7eV X射线源的AlKα单色化辐射的Thermo Scientific K-Alpha仪器对每种类型的未处理和7分钟NTAP处理的缝合线样品进行X射线光电子能谱（XPS）测量。使用具有128-多通道检测器系统的180°双聚焦半球形电子能量分析仪。将分析室泵送至2×10-7毫巴的压力。在每个样品表面积的单点分析中，使用具有50eV通过能量的恒定分析仪获得测量光谱和高分辨率光谱。 X射线束尺寸为300μm，检测器输入角度为45°。使用具有高斯/洛伦兹峰形状和Shirley / Smart型背景的Avantage XPS软件分析数据。通过将较低结合能C 1s光峰设定在285.0eV C 1（s）烃峰来完成电荷参考。

统计分析
除非另有说明，否则所有实验重复三次，并且在每次复制中使用三种不同的样品（n = 9）。使用SPSS 13.0进行统计学分析。学生t检验和单因素方差分析（ANOVA）分别进行配对比较和多重比较，p <0.05被认为是显著的。

结果
缝合线去污
对于所有缝线类型，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的定殖被确定为约3-log。 受污染的缝合线的3分钟NTAP处理完全灭活（p <0.05）每种缝合线样品上的定植细菌（图2A-2C）。 在TSA平板上孵育后污染的（对照）和NTAP处理的缝合线样品的图片显示出与菌落数一致的结果。 对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，每种类型的对照缝线样品周围都有明显的细菌生长区，而在NTAP处理的缝线样品周围没有观察到生长（图2A）。 此外，在进一步孵育样品48小时后，为了排除任何可能的休眠，在NTAP处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的缝合线样品周围没有观察到生长。


图2
NTAP处理对污染缝合线的抗菌作用。
（A）在未处理的缝合线样品周围的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长在TSA平板上清晰可见，而在3分钟NTAP处理的缝合线周围没有观察到细菌生长。培养皿左侧的缝合线未经处理（对照缝合），培养皿右侧的缝线是NTAP处理的样品。 （B）对照和3分钟NTAP处理缝合线的每厘米缝线片段的金黄色葡萄球菌的对数生长。 （C）每cm缝合对照片段和3分钟NTAP处理的缝合线的大肠杆菌的对数生长。

预防缝线细菌定植
如图3A所示，7分钟NTAP处理显著阻止了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在每种缝合线上的定植。在TSA平板上孵育的每种类型的对照缝线周围的生长区是明显的，而在NTAP处理的缝合线周围没有观察到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。此外，存在抗微生物ALCALATINE缝合线周围的生长区。将缝合线在TSA板上进一步孵育48小时也未显示NTAP处理的缝合线样品周围的任何生长。这些观察结果与图3B和3C中表示的结果一致。菌落计数测定结果还清楚地表明，7分钟NTAP处理完全阻止金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在每种类型的NTAP处理的缝合线样品上的定殖（p <0.05）。与去污实验的结果类似，确定对照缝合线上的3-log生长，而在NTAP处理的缝合线上未确定生长。


图3
NTAP治疗后预防缝线碎片细菌定植。
（A）在未处理和抗微生物ALCALACTINE缝合线样品周围观察到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，而在TSA平板上的7分钟NTAP处理的缝合线样品周围未观察到细菌生长。培养皿左侧的缝合线未经处理（对照缝合），培养皿右侧的缝线是NTAP处理的样品。 （B）对照和3分钟NTAP处理缝合线的每厘米缝线片段的金黄色葡萄球菌的对数生长。 （C）每cm缝合对照片段和3分钟NTAP处理的缝合线的大肠杆菌的对数生长。注意，在未处理的缝合线样品上观察到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌约3-log生长，而在7分钟NTAP处理的缝合线样品上未观察到生长。

此外，评估NTAP治疗对持续预防定植的影响持续较长时间。为此目的，在完成等离子体处理后，在无菌条件和室温下将NTAP处理的缝合线保持1,3,5,7和10天。然后，进行微生物实验。如图4A所示，在7分钟NTAP处理的单丝PDO和PGCL缝线样品周围未观察到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。然而，在延迟10天后，在7分钟NTAP处理的复丝PGLA和PGA缝合线周围可见金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。另外，如图4B和4C所示，对于所有延迟时间点，在7分钟NTAP处理的单丝PDO和PGCL缝线上未检测到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的定殖，而大约3-log生长是在未处理的PDO和PGCL缝合线上测定（p <0.05）。然而，对于所有延迟时间点，在7分钟NTAP处理的复丝PGLA和PGA缝线上测定与未处理的对照样品相当的金黄色葡萄球菌的3-log细菌定植。在大肠杆菌的延迟期内，7分钟NTAP处理的复丝PGLA和PGA缝线的定殖预防效果逐渐降低。大肠杆菌在未处理的对照PGLA和PGA缝合线上显示出3-log定植。延迟1天后未检测到大肠杆菌在7分钟NTAP处理的PGLA缝合线上的定殖，而在第3天，第5天，第7天和第10天，大肠杆菌的定殖约为1.5 log（p <0.05） ）。在7分钟NTAP处理的PGA缝合线中，大肠杆菌定植显示逐渐增加，其中分别观察到1.9,2.08,2.89,3.01和3.12对数的定植，延迟分别为1,3,5,7和10天。发现在7分钟NTAP处理的PGA缝合线上预防大肠杆菌定植在延迟期的第1天和第3天具有统计学显著性（p <0.05）。


图4
NTAP治疗后细菌定植的持续性。
（A）在NTAP处理7分钟后10天，在琼脂平板上生长金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的代表性图像。注意，即使在TSA平板上NTAP处理10天后，也未观察到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，PDO和PGCL缝合。培养皿左侧的缝合线未经处理（对照缝合），培养皿右侧的缝线是NTAP处理的样品。 （B）在NTAP处理7分钟后，每cm缝合片段1,3,5,7和天后金黄色葡萄球菌的对数生长。在给定的时间点防止金黄色葡萄球菌在PDO和PGCL缝合线上的定殖，然而即使在NTAP处理7分钟后一天，金黄色葡萄球菌也粘附在PGLA和PGA缝合线上。 （C）在NTAP处理7分钟后，每cm缝合片段1,3,5,7和天后大肠杆菌的对数生长。在给定的时间点防止金黄色葡萄球菌在PDO和PGCL缝线上的定殖，而PGLA和PGA缝合线上的金黄色葡萄球菌定植随着延迟时间的增加而增加。

接触角测量
接触角测量表明，在7分钟NTAP处理后，缝合线样品的亲水性显著增加，如图5A所示。对于PGLA，PGA，PDO和PGCL，未处理的对照缝合线的接触角分别确定为124°，109°，133°和115°。在NTAP处理后，将每种缝合材料的接触角确定为0°（p <0.05）。而且，如图5B所示，水滴完全在NTAP处理的缝合线上扩散。


图5
与未处理的缝合线相比，NTAP处理的缝合线上的水接触角的变化。
（A）缝合线经过7分钟NTAP处理后，所有缝合材料的水接触角降至0°。 （B）由于通过7分钟NTAP处理获得的0°接触角，可以通过肉眼观察水滴在缝合线样品上的分散。

缝合线的退化
对照和NTAP处理的缝合线的重量测量继续进行，直到缝合线碎片破碎，同时用镊子操纵样品。如图6所示，NTAP治疗没有改变缝线破碎的时间。详细地，对于未处理对照和7分钟NTAP处理的PGLA，PGA，PDO和PGCL缝合线，NTAP处理后65,60,60和45天测定降解时间。当降解发生时（换句话说，样品破碎的时间），未处理和7分钟NTAP处理的缝合线样品的剩余重量百分比被确定为PGLA的62％和54％（p PGA（p> 0.05），61％和59％，PDO（p <0.05）分别为67％和78％，PGCL分别为68％和71％（p> 0.05）（图6A-6D） ）。


图6
7分钟NTAP处理后缝合线样品的降解。
通过重量测量确定（A）PGLA，（B）PGA，（C）PDO和（D）PGCL缝线在37℃下在PBS溶液中的降解，直到缝合片段在操作期间破碎。

缝合线的拉伸测试
如图7所示，在缝合线的7分钟NTAP处理后，对于PGA和PGCL，观察到缝合线可承受的最大力没有统计学上显著的变化。 详细地，未处理的对照和NTAP处理的缝合线可承受的最大拉伸力分别测量为PGA的133N和133.9N（p> 0.05）和PGCL的162N和163N（p> 0.05）。 相反，NTAP治疗显著降低了PGLA和PDO缝合线可承受的最大力。 未处理的对照和NTAP处理的缝合线可承受的最大拉力分别测量为PGLA的128N和116N（p <0.05）和PDO的104N和90N（p <0.05）。


图7
在7分钟NTAP治疗之前和之后缝合线可承受的最大拉力。
PGA和PGCL缝合线可承受的最大拉力不会因7分钟NTAP处理而改变。 然而，7分钟的NTAP治疗导致PGLA和PDO缝合线可承受的最大拉力减小。

体外划痕伤口测定
如图8A所示，与产生划痕伤口3天后的对照和未处理的缝合线样品相比，所有类型的7分钟NTAP处理的缝合线样品明显加速了划痕伤口区域的愈合。 在创建划痕后的3天结束时，对照组的伤口面积确定为72％，而NTAP处理的PGLA，PGA，PDO中的伤口面积降至40.5％，47.7％，45.9％和47.6％。 PGCL缝线分别（p <0.05）（图8B-8E）。


图8
NTAP处理缝合线对伤口愈合的影响。
（A）通过引入7分钟NTAP处理的缝合线样品，光学显微镜图像清楚地显示加速的伤口愈合。当使用ImageJ软件定量（B）PGLA，（C）PGA，（D）PDO和（E）PGCL缝线在伤口划痕模型上孵育时的剩余伤口区域。

扫描电子显微镜（SEM）成像
在100X和2500X放大率下收集未处理对照和7分钟NTAP处理的缝合线样品的SEM显微照片，以观察对缝合材料的任何可能的破坏性影响，并分别评估对缝合线的修改。在SEM成像期间，扫描整个样品并且在图9A-9D中呈现代表性图像。缝合线的平均直径为约0.5μm。复丝PGLA和PGA缝合线包含10-15nm的单丝。 100 X放大的SEM显微照片未显示NTAP处理对所有类型的缝合线样品的任何破坏性影响。然而，与2500X放大的SEM显微照片中的对照样品相比，观察到除了PGLA之外NTAP处理的缝线中增加的表面粗糙度。


图9
在NTAP处理之前和之后的缝合线样品的扫描电子显微镜图像。
在100倍和2500倍放大率下在7分钟NTAP处理之前和之后获得（A）PGLA，（B）PGA，（C）PDO和（D）PGCL缝合线的SEM图像，以分别评价结构和表面特征。

傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析
图10显示未处理和NTAP处理的缝合线的FTIR光谱。在1720cm -1（C = O，羰基），1124cm -1（C-O-C，醚），1070和1050cm -1（C-O，酯）附近观察到特征吸收带。 C-H拉伸和弯曲模式分别在2910和1427cm -1处发现。 800-1200 cm-1的范围属于C-C延伸。尽管在FTIR分析中未处理和7分钟NTAP处理的PDO和PGCL缝线之间没有显著差异，但认为PGA和PGLA样品中1500-1700cm-1的显著增加归因于NH组。同样，在3100-3700 cm-1范围内的PGA和PGLA样品的明显宽带与增加的OH信号有关。通常，在这种相对吸收强度的情况下，C-O和C = O基团增加，而C-C基团在NTAP处理时降低。


图10
NTAP处理前后缝合线的FTIR光谱。
通过使用FTIR评估通过7分钟NTAP处理对（A）PGLA，（B）PGA，（C）PDO和（D）PGCL缝线引起的化学修饰。 FTIR光谱显示，7分钟NTAP处理导致C-C基团的相对吸收强度降低，并且C-O和C = O基团的相对吸收强度增加，表明亲水性增加。

X射线光电子能谱（XPS）分析
还通过XPS测定缝合线样品的NTAP修饰（图11）。对样品的广泛调查包含来自聚合物主链的信号，即C和O.没有N组分是明显的;然而，在NTAP处理后检测到N为PGA。相应的表面元素组成在表1中给出。由于NTAP处理后C-O和C = O键的增加，氧信号的高度增加。在等离子体处理之前和之后用于缝合线的C 1的光电子分布图显示在约285eV，287eV和289eV处观察到的三种不同信号。这些特征归因于结构中的三种不同的C环境，即C-C，C-O和C = O.


图11
NTAP处理前后缝合线的XPS C1s谱。
通过使用XPS评估通过7分钟NTAP处理对（A）PGLA，（B）PGA，（C）PDO和（D）PGCL缝线引起的化学修饰。 C 1s的XPS光谱显示在7分钟NTAP处理时氧信号增加。

表格1
在NTAP处理7分钟之前和之后缝合的原子组成和相对峰强度。


讨论
与植入人体的所有医疗器械类似，缝合线为细菌定植提供了极好的介质。手术部位上缝线材料的存在显著增加了伤口对感染的易感性。与缝线相关的手术部位感染主要与缝合材料上的生物膜形成有关[10]。

细缝与缝合材料的粘附是生物膜形成的关键步骤，其可能导致手术部位感染。据报道，将缝合材料植入手术部位后的前4至6小时是初始细菌粘附的最关键时期[39]。此外，细菌在缝合线表面上的粘附损害了由粒细胞介导的伤口去污的局部机制[3]。因此，在此期间防止细菌粘附和/或根除粘附的细菌进行缝合对于预防手术部位感染很重要[5,39]。

开发抗微生物（如三氯生）的缝合线以防止手术部位感染。尽管三氯生涂层缝合线在体外和临床应用中取得了成功，但在一些外科手术中其功效可能仍然不足[1]。此外，已经报道了三氯生对人类和各种动物模型的生殖系统的潜在毒性作用[10]。三氯生还导致外排泵系统活动增加，这可能导致多药耐药性的升高[40]。因此，作者尝试利用NTAP治疗来开发用于预防和控制手术部位感染的新型抗菌缝合线。

NTAP处理在各种表面上引起强烈且广泛的抗微生物活性，并且已经报道了其用于医疗装置（包括心脏起搏器，金属植入物和超声造影剂）的去污的应用[28,41,42]。

NTAP处理的抗菌作用归因于血浆生成的ROS的协同作用，包括超氧化物（O2-），过氧化氢（H2O2），羟基自由基（OH&#8226;），臭氧（O3）和包括一氧化氮（NO）在内的RNS ，硝酸盐（NO3-），亚硝酸盐（NO2-），过氧亚硝酸盐（ONOO-），它们会诱导氧化应激和随后的氧化损伤，如膜脂质过氧化和核酸对微生物的氧化损伤，从而导致失活[31,41， 42。此外，即使在NTAP形成过程中产生的紫外线不被认为是抗菌活性的主要因素，它也可能有助于NTAP治疗的抗菌作用[43]。

在本研究中，对所有测试的污染缝合材料进行3分钟NTAP处理，导致大肠杆菌和金黄色葡萄球菌完全失活（图2）。因此，植入后立即对植入的缝合线进行NTAP治疗可被认为是根除缝合线上粘附的病原体和预防手术部位感染的有效方法。

除了通过NTAP处理直接根除缝合线上粘附的细菌之外，可以修改缝合线以通过相对长的NTAP处理防止细菌在其上定植。如图3所示，用NTAP预缝合缝合线7分钟可防止缝合线上的细菌定植。值得注意的是，与抗菌药物（即氯己定二乙酸酯）缝合线相比，7分钟NTAP处理的缝合线对于预防缝合线上的细菌定植提供了优异的效果。用NTAP预缝合缝合线7分钟，防止大约3-log的细菌粘附。在所有测试的缝合材料中，这种效果是均匀的，包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的单丝和复丝。在本研究中，还评估了长达10天的7分钟NTAP治疗的持续细菌定植效果的预防。如在图7中在NTAP预处理7分钟后的第4A天所示，观察到PGLA和PGA缝合线周围的细菌生长，而在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的PDO和PGCL缝线周围没有观察到生长。这样的结果可归因于单丝和复丝缝合材料的总表面积的差异。可以在图9中所示的SEM图像上观察单丝和复丝缝合材料的表面积的差异。

单丝缝线制造为单根纤维，其横截面为圆形。然而，复丝（或编织）缝线是通过扭转相对较细的细丝而产生的，这些细丝产生类似于锯齿状圆的横截面，具有更大的总表面积[3,44]。与复丝缝合相比，单丝缝合线与NTAP放电接触的单位表面积（或详细说明放电与表面积的比率）将更高。此外，复丝缝合线的较大表面积和锯齿状表面构成复杂的三维表面形貌，为细菌粘附提供更充分的表面[3]。另外，据报道，与单丝缝合相比，复丝缝合更容易进行微生物定植[3,15]。因此，在NTAP治疗期的7分钟内，与复丝缝合相比，复丝缝合线将被更大程度地修改。

通过图4A的仔细检查，可以注意到，在7分钟NTAP预处理后第10天，大肠杆菌在PGLA和PGA缝合线周围的生长相对小于金黄色葡萄球菌的生长。发现该观察结果与菌落计数数据的数据一致。如图4C所示，PGLA和PGA缝合材料上的大肠杆菌数量随着延迟时间的增加而增加。然而，对于PGLA和PGA缝合材料上的金黄色葡萄球菌，NTAP处理的细菌粘附防止效果不是持久的。甚至在对RALA和PGA缝合线进行7分钟NTAP处理后1天，观察到与对照组相似的每厘米金黄色葡萄球菌缝线片段约3-log生长。以前的研究报道，与大肠杆菌相比，金黄色葡萄球菌更容易粘附在复丝缝合线表面上。此外，金黄色葡萄球菌倾向于将缝合线表面粘附成簇，而大肠杆菌单独粘附缝合线表面[2,45]。缝合材料本身也可能是细菌粘附的一个因素。马西尼等人。据报道，与其他缝合材料相比，PGA缝合导致更高的细菌粘附[20]。此外，Grigoras等人。据报道，PGA缝合材料允许最高的细菌粘附，而PDO缝合允许最少的细菌粘附[9]。

在文献[35,37,38]中已经报道了NTAP处理的各种表面如乳胶，藻酸盐凝胶和金属的抗菌，细菌粘附和生长预防作用。积累的血浆产生的ROS，RNS和自由基，如上述超氧化物（O2-），过氧化氢（H2O2），羟基（OH&#8226;），臭氧（O3）一氧化氮（NO），硝酸盐（NO3-）材料表面的亚硝酸盐（NO2-），过氧亚硝酸盐（ONOO-）和NTAP处理过的表面的化学修饰与那些等离子体产生的ROS，RNS和自由基被认为是血浆的抗菌和细菌粘附预防效果的来源[ 35,38]。

尽管缺乏关于表面疏水性/亲水性和细菌粘附的普遍一致，但表面和细菌之间的疏水相互作用被认为有助于细菌粘附到表面和随后的生物膜形成。例如，一些研究表明，亲水性表面上的细菌粘附和随后的细菌定植和生物膜形成可以大大减少[9,37,46]。此外，NTAP形成过程中产生的紫外线也可能有助于防止细菌粘附到缝合线表面，因为之前已报道过光功能化钛表面的亲水性增加[46]。如图5A所示，在7分钟NTAP处理后，所有测试的缝合材料的接触角显著降低并且表面变得超亲水。缝合材料的超亲水特性可能是预防NTAP处理缝合线上细菌定植的主要因素。 NTAP处理后缝合材料的亲水性增加可能与空气等离子体产生的活性物质有关，如原子氧（O），过氧化氢（H2O2），羟基（OH&#8226;），臭氧（O3）和自由基。可能与缝合材料发生反应，在缝合线表面形成极性基团。在本研究中，可能已经在缝合线表面上引入了含氧基团如羧酸（COOH），因为通过FTIR分析证实了-OH和C-O以及C = O键的存在。此外，通过XPS分析证明，与未处理的缝线相比，NTAP处理时原子组成的变化，特别是C-C，C-O和C = O键的强度变化。

缝合线的主要功能之一是在手术伤口的愈合过程中提供机械支撑[8,20]。因此，排除NTAP处理对缝合线拉伸强度的任何可能的负面影响是很重要的。在7分钟NTAP处理之前和之后确定缝合线可承受的最大拉力。没有发现PGA和PGCL缝合线的最大拉伸强度的统计学显著变化。如图7所示，PGLA和PDO的最大拉伸强度显著降低。然而，在7分钟NTAP处理后，PGLA和PDO缝线的拉伸强度的降低在基于欧洲的可能的实际应用方面不被认为是缺点。药典。据报道，欧洲药典要求缝合线的最小拉伸强度值为50.8N [47]。总体而言，所有缝合线（包括NTAP处理的缝合线）的最大拉伸强度均在欧洲药典要求的范围内。

除了NTAP和NTAP处理材料的抗微生物作用外，还证实了NTAP和NTAP处理材料的伤口愈合效果[48-50]。总之，NTAP处理具有选择性作用，其中它提供微生物灭活，同时促进真核细胞的生长[51]。在本研究中，未观察到NTAP处理的缝合材料对L929细胞系活力的不利影响。相反，观察到当用7分钟NTAP处理的缝合材料孵育时促进L929细胞的生长。如图8所示，对刮伤区域的光学显微图像的视觉检查显示，与对照和未处理缝合组相比，所有时间点的7分钟NTAP处理的缝合材料显著增加了伤口愈合。在大多数伤口区域被L929细胞覆盖时，在孵育的第3天伤口愈合的增加更加突出。伤口愈合的定量表明，与对照组相比，即使未治疗的缝合线也显示出促进的伤口愈合效果。除此之外，经过7分钟NTAP处理的缝线显著增加了伤口愈合过程。在第3天，伤口面积的约55％-60％被L929细胞覆盖，取决于缝合材料，而对照和未治疗的缝合组的闭合伤口面积分别被确定为28％和约40-45％。 （图8B-8E）。对于各种类型的7分钟NTAP处理的缝合线确定的伤口面积没有显示出任何统计学上显著的差异。如文献中所述，用NTAP产生的活性氧（ROS）充当信号分子并加速伤口闭合[52-55]。在另一项研究中，Murrell等人。据报道，ROS显著促进人成纤维细胞的迁移和增殖[56]。此外，作者之前已经证明，当将提取的培养基应用于由L929小鼠成纤维细胞开发的划痕试验时，NTAP处理的电纺聚乙烯醇（PVA）/聚丙烯酸（PAA）纳米纤维显著增加伤口闭合[57]。因此，作者强烈推测提取物介质作为ROS转移介质起到刮擦部位的作用，并通过增强成纤维细胞的迁移和增殖来固定伤口闭合。

在本研究中测试可吸收缝合线时，还评估了7分钟NTAP处理的缝合线的可降解性以及未处理的缝合线。聚合物缝合线的生物降解性定义为在生理环境中通过酶促或水解过程分解的分子键[58,59]。特别是，基于PGA，PLGA，PDO和PGCL的缝合线主要通过水分分子渗透和裂解酯键的水解机制降解[60]。可降解缝线的羧基端基上的质子被认为是这种降解过程的驱动力[59]。温度，酯基密度，表面积，分子量和结构是影响水解生物降解的主要因素[44]。在该研究中，通过在37℃和pH 7.4的PBS中孵育来分析不同缝线的体外降解行为，如先前由Im等人报道的。 [61]。对照和7分钟NTAP处理的PGA和PGCL缝线的重量没有显示出统计学上的显著差异（p> 0.05），而对照和7分钟NTAP处理的PGLA和PDO缝合线的重量差异被发现是在最后一次重量测量中，统计学上显著，其中在测量操作期间缝合线碎片被破碎。这种变化可能与张力测量实验相关，其中7分钟NTAP处理的PGLA和PDO缝合线发现缝合线能够承受的最大拉力的统计学显著降低，而PGA和PGCL缝合线未发现统计学上显著的变化。 。尽管与对照组相比，7分钟NTAP处理的缝合线的退化模式发生了改变，但缝合材料破碎的时间点没有改变。这些结果可以通过NTAP处理所施加的化学改性程度来解释，NTAP处理限于缝合线表面而不是渗透到整体结构，因为降解过程从聚合物表面开始并逐步向更深处层进行。[44]。

生理条件下PGLA，PGA，PDO和PGCL缝合线的伤口支持期分别由制造商报告为约30,30,60和21天。作者的数据显示，7分钟的NTAP治疗不影响伤口支持期，即伤口材料能够承受开放性伤口施加的拉力的时间以及缝合线可以为伤口提供机械支撑的持续时间。总的来说，在拉力测量和降解实验的基础上，7分钟NTAP治疗并未显著影响所有测试缝合线的机械和伤口支撑性能。

结论
在本研究中，评估了NTAP处理对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌灭活的效果以及对NTAP处理的缝合线上的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌定植的预防。作者已经证明，3分钟NTAP处理可导致金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的3-log / cm缝线完全失活。此外，缝合线的NTAP预处理阻止了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在缝合线上的定植。对于PDO和PGCL，NTAP预处理的定植预防效果持续长达10天。经NTAP处理的缝合线也有助于并加速刮伤模型中的伤口愈合。还评估了缝合线的机械性能，作者的结果表明NTAP处理不会对缝合线的机械性能产生不利影响。化学表征结果显示，血浆产生的ROS / RNS与缝合材料相互作用，使缝合线表面更具亲水性，这似乎是NTAP治疗介导的作用的核心。据作者所知，本研究是文献报道中的第一篇，证明NTAP治疗手术缝合线可显著防止细菌粘连，从而预防缝线相关的SSIs。

总之，NTAP治疗PGLA，PGA，PDO和PGCL缝线有效地灭活和防止手术缝合线上的细菌生长，并且NTAP处理的缝合线可以被认为是用于预防和控制缝合线相关手术部位感染的新型替代方案。

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