闭合性大鼠胫骨骨折模型的优化

概要
背景
考虑到骨折部位周围的骨膜和软组织在骨折愈合过程中起重要作用，使用闭合骨折模型已成为研究骨折愈合过程的首选模型。一些技术如截骨术，钻长骨和使用类似断头台的装置来诱导骨折，其特征在于一些不良效果和并发症。本研究的目的是使用三点弯曲钳优化和评估体内骨折模型，该钳可用于研究大鼠的继发性骨折愈合。

方法
使用改良的三点弯曲钳作为装置以产生闭合的大鼠胫骨骨折，其在大鼠中以髓内钉（23G×11/2“）为前缀。诱导闭合骨折的确切位置沿着长骨。在骨折诱导后直至第6周立即检查骨粉碎和骨折骨对齐的存在。

结果
诱发的所有骨折都是横向的，位于胫骨的中间至近端三分之一处，并且它们全部愈合而没有并发症。如图所示骨折在术后2-3周内发生。骨折线与胫骨轴的平均角度为89.41±2.11°。外侧和前后针角度分别为167.33±3.67°和161.60±4.87°。与完整骨的整个长度相比，骨折近端的平均长度为41.02±3.27％。总愈伤组织面积和总愈伤组织指数的百分比存在显著差异，而X射线愈伤组织指数没有显著差异。在轻微粉碎（n = 4）和非粉碎（n = 21）之间，总愈伤组织面积没有显著差异。

结论
优化的大鼠胫骨骨折模型主要导致胫骨中段骨折，骨粉碎最小，无周围软组织损伤。随后的软骨痂形成的大小区域和闭合骨折模型可重复的程度是非常好的结果，使其可用于体内实验室研究。

关键词：骨折模型，大鼠，胫骨，体内

背景
需要治疗的大量严重受伤患者和与骨骼损伤相关的长期发病率不可避免地导致更大的社会经济影响。因此，为了提高患者护理质量并降低治疗成本，正在进行研究和临床工作以开发新疗法以增强骨折愈合，从而缩短恢复期（Yukata等，2014; Zhang等。 ，2017）。在导致血肿的血管破裂并激活凝血级联中的血栓形成因子后，骨折愈合过程开始。这导致炎症反应，其中细胞因子和生长因子募集骨质祖细胞和间充质细胞，其在骨折的边缘处产生肉芽组织。然后将肉芽组织替换为骨，通过膜内（直接）骨形成或通过透明软骨组织形成，随后通过软骨内（间接）骨形成矿化至编织骨（Shapiro，2008; Ghiasi等，2017） 。然后，这导致骨折稳定并且组织随后被重塑。一些作者已经描述了用内部或外部固定手动造成的大鼠胫骨骨折作为研究骨折愈合的模型。内部或外部固定的不充分稳定性导致在愈合期间骨片的不同程度的位移和重复移动（Slätis和Rokkanen，1965,1967; Glatt等，2017）。理想的实验性骨折应该是一致的部位，骨损伤的标准程度，软组织损伤，骨碎片的稳定性和位移，骨结合所需的时间也应该标准化（Greiff，1978）。软组织在骨折愈合中也具有重要作用。例如，骨折周围的愈伤组织形成提供暂时稳定。各种介质的释放和新形成的血管的萌芽也是由环境中的软组织引起的。此外，周围肌肉有助于稳定和加强长骨骨折（Otto等，1995; Loi等，2016）。

1984年，Bonnarens和Einhorn基于Jackson等人之前设计的模型描述了大鼠的骨折模型。 （1970年）。在该模型中，在骨折之前使用以逆行方式插入膝部的髓内（IM）针进行骨缝合术（Aurégan等人，2013）。然后，固定的重量落在放置在钝的断头台上的骨上，形成股骨的标准化的闭合中轴骨折。

一些研究报道了使用这种钝性断头台技术在大鼠股骨骨折模型中复发并发症，包括死亡，错位骨折，过度粉碎和深部感染（Aurégan等，2013; Haffner-Luntzer等，2016）。

此外，在骨折愈合过程中，骨折粉碎程度似乎特别难以控制（Pei和Fu，2011; Ghiasi等，2017）。由于破碎程度可以影响愈伤组织的形成，因此使用的大鼠骨折模型与产生的粉碎愈伤组织之间存在关联。使用类似的原理，Grieff（1978）使用断头台装置在大鼠胫骨骨折模型中产生骨折，结果显示轻微粉碎但骨碎片的高位移和超过10°的针角度。奥托等人。 （1995）在大鼠胫骨骨折模型中使用三点钳显示出最小的水肿和死亡，但是在手术后六个月和针头角度为80±2之前，胫骨骨折的缩短率很高，愈伤组织仍然可见°。由于现有骨折模型的这些局限性，需要可靠且可重复的实验动物的可靠骨折模型，特别是在大鼠中。该研究的目的是基于Grieff（1978）和Otto等人的研究，优化闭合性大鼠胫骨骨折模型。 （1995）并评估该模型可以在多大程度上克服当前的局限性，并提供一种更好的技术，创建一个具有更一致和可重复结果的大鼠骨折模型。

方法
动物
本研究中的所有实验设计均得到马来西亚Putra大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（UPM / IACUC / AUP-R028 / 2015）。初步研究分别使用30周龄和8周龄的10只（n = 10）和71只（n = 71）大鼠尸体。根据AICUC的指导原则，将尸体大鼠人道地杀死用于其他实验。使用如下所述的三点弯曲钳诱导骨折。在体内研究中，使用总共225只（n = 25），8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠，平均体重为187.04±10.15g。在实验开始之前允许一周的适应期。在适应期后手术前将大鼠饥饿12小时。

手术程序
所有手术都是在全身麻醉下使用盐酸氯胺酮（Narketan®，Troy Laboratories PTY Limited，澳大利亚）和赛拉嗪（Ilium Xylazil-100®，Troy Laboratories PTY Limited，澳大利亚）的预混合物对动物进行的（McKelvey和Hollingshead，2004） ）。通过肌内注射给每只大鼠氯胺酮（40mg / kg）和甲苯噻嗪（5mg / kg）进行手术和放射线照相。还给予Xylocaine 2％局部麻醉（Xylocaine，AstraZeneca，UK）皮下注射。进行手术部位的常规手术无菌皮肤准备。

使用手术刀刀片＃15（Bbraun，德国），通过膝关节头侧的4mm皮肤切口接近手术部位。用不锈钢暴露胫骨平台，并通过胫骨平台手动引入尖锐的探针，颅骨到前十字韧带的附着和两个半月板的前角之间以确定髓内针入口的面积。插入23 G 11/2“针（BlBraun，Bbraun，Germany），直至其在胫骨远端遇到阻力。针的穿透深度约为22毫米。在完全穿过胫骨引入髓内钉之后，使用骨切割器将多余的近端针头端部冲洗。用简单中断的不可吸收的4/0尼龙缝合线（Ethilon *，Ethilon.LLC）封闭切口。

为了诱导大鼠胫骨骨折，通过修改Otto等人的上圆压缩钳口构建了经过特殊改良的三点弯曲钳（Schippers®，MS，荷兰）（图1）。 （1995）根据Grieff的压缩机叶片（1978）的装置，其尺寸为边缘10×0.1mm。此外，三点弯曲钳的两个支撑钳被修改为7毫米而不是17毫米，如Otto等人所述。 （1995）设备。


图.1
照片显示该装置在大鼠中产生胫骨骨折的应用（插图，使用的改良三点弯曲钳）

钳子的位置是双支撑钳口位于胫骨中轴的内侧，而钳口位于外侧。在使用钳子后，目视控制位置，并且钳子关闭直到听到裂缝声并且钳子的阻力突然下降。此后压力立即释放。上述相同的原理适用于在大鼠尸体中产生胫骨或股骨骨折。在左胫骨上产生骨折，并且使用右侧对侧完整的胫骨作为对照。将每只动物保持在单独的笼子中以允许在手术后自由移动。剂量为5mg / kg曲马多（Analab®，Biolab，泰国）每天一次给药，持续3天，作为手术后的镇痛。安乐死后不同时间点进行大体观察和放射学评估，使用20mg / kg注射IP的高麻醉剂量的戊巴比妥（Society and States，2013）。

骨折的总体评价
检查断裂腿的皮肤是否有由钳子下颚引起的任何伤口。由于是闭合性骨折，髓内钉预先固定在骨折骨中，因此骨折被认为是稳定的，不需要额外的术后外部支撑绷带。从诱导的和非骨折的肢体（对照）收集解剖的胫骨。在每个时间点，即在手术后第1,2,3,4和6周处死5只（n = 5）大鼠。从解剖的骨折胫骨和对照确定总愈伤组织指数和愈伤组织面积大小（Greiff，1978; Otto等，1995; Eastaugh-Waring等，2009;Aurégan等，2013）。使用安装在3.1 M像素数码相机（VIS Imaging UC3010，Malaysia）（毫米测量单位）上的解剖立体显微镜（HUVITZ; HSZ-645TR，韩国）来捕获解剖的骨骼图像并测量愈伤组织宽度（mm）大鼠左侧胫骨骨折愈合形成愈伤组织。使用对侧大鼠右胫骨作为对照，并使用ImageJ软件（1.48V，NIH，USA）将数据用于确定愈伤组织指数的比率。使用相同的软件测量愈伤组织面积大小，愈伤组织指数，针角度，近端骨折，全长骨折和正常对照骨。

骨折的放射学评估
在手术后立即和之后的每周，使用X光机（Orange 10040HF，Econet Medical，Korea）在两个视图（前后（AP）和侧视图）上对骨折和对侧完整的胫骨进行射线照相。获得的X射线照片用于骨愈合的客观评估，使用诸如骨愈合，愈伤组织形成的大小，骨粉碎程度，针角度和射线照片愈伤组织指数等标准。放射线照片愈伤组织指数定义为胫骨中段骨折愈伤组织形成的最大宽度，包括原始骨骼除以对侧对照骨骼的宽度。粉碎性骨折是骨折裂或断裂成两个以上的碎片，这些碎片在骨折部位放射照相。观察到三种类型的粉碎：首先，在前后位的两个放射学观察视图中未检测到粉碎（没有第三个碎片）;其次，用较小的碎片轻微粉碎，其中尺寸小于针直径，即<1.1mm，第三，严重粉碎（≥一个大于髓内针直径的大碎片）（Aurégan等，2013）。

骨折的组织学检查
在骨折后第1,2,3,4和6周处死动物，并且每周从骨折的肢体收集解剖的胫骨样品（n = 5）。将骨头向近端和远端切割至骨折部位2mm（其中形成粗大的愈伤组织），在甲醛10％中固定24小时，在10％甲酸中脱钙4天，然后进一步加工，切片（5μm）用标准方法用苏木精和曙红（H＆E）染色（Kiernan，2000; Bancroft和Gamble，2007）。

统计分析
统计SPSS软件版本20（Armonk，IBM，USA）和SAS软件（SAS，TAKS，England）用于数据分析。作者使用2对样本学生t检验来比较没有粉碎的组和轻微粉碎的组，以及用于其他数据分析的单向ANOVA。报告平均值的标准误差，P <0.05被认为是统计学上显著的。

结果
使用30周龄大鼠尸体（n = 10）的初步研究表明，产生的胫骨骨折主要是粉碎性，倾斜性和远端性。 在使用8周龄大鼠尸体（n = 65）的下一个实验中，结果显示胫骨的非粉碎，横向和中轴是主要的骨折（表1）。

表格1
两种不同年龄大鼠胫骨骨折类型的比较


Asuperscript表示30周龄大鼠的最高数量，而B上标表示8周龄大鼠的最高数量

在另一个实验中，使用8周龄的大鼠尸体（n = 6）来比较股骨和胫骨之间诱发的骨折类型。 股骨和胫骨的骨折类型主要是横向和非粉碎性骨折，位于骨中轴（图2）。 胫骨（n = 3）和股骨（n = 3）之间的数据比较显示两组之间的粉碎性骨折类型和位置没有显著差异（双尾t检验）。


图2
使用改良的三点弯曲钳在大鼠尸体中产生胫骨和股骨骨折。数据以平均值±SE表示，误差棒表示标准误差

在体内研究中，发现所有诱发的骨折都位于胫骨的中间三分之一处。平均手术时间为3.90±0.55分钟。所有动物均在手术中存活，没有任何并发&#8203;&#8203;症，骨折部位软组织损伤或邻近膝关节和踝关节僵硬。在骨折部位未见伤口或坏死和严重水肿的迹象。骨折后24小时，大鼠表现出正常行为，开始三条腿走路并抬起骨折的腿。手术后一至两周，大鼠开始在受影响的肢体上承受重量。之后2周，&#8203;&#8203;所有大鼠开始对所有四肢显示负重。

安乐死和胫骨解剖后愈伤组织区域的总体外观显示，与右侧胫骨（对照）相比，左侧胫骨形成明显的愈伤组织（图3）。


图3
骨折胫骨愈合组织（箭头）左侧带有髓内钉（L）（黄色箭头），右侧带有完整的胫骨（R）用于比较

在第1周观察到解剖的愈伤组织形成，并且直到第6周逐渐减少。总愈伤组织面积（图4）和总愈伤组织指数（图5）的统计分析通常显示在第1周与其他周相比有显著差异（ P <0.0065;单向ANOVA）。


图4
总愈伤组织面积百分比条形图。 该图表显示大鼠胫骨骨折后不同周（n = 25）的平均值±SE。 误差棒表示标准误差。 具有不同上标的每列中的平均值显著不同


图5
总愈伤组织指数形成的图表。该图表显示手术后第1,2,3,4和6周（n = 25）。误差棒表示标准误差。具有不同上标的每列中的平均值显著不同（P <0.0006）

通过测量骨折线与胫骨长轴之间的角度来确定骨折类型的放射学评估。引起的主要骨折类型是横向（89.41°±2.11）。近端骨折骨与完整骨长度的平均长度为41.02±3.27％。 IM引脚从外侧和前后位置的平均角度分别为167.33°±3.67°和161.47±4.87°。

从第二周开始，在X射线照片上可以清楚地看到骨折部位周围的愈伤组织形成。在第3周至第4周，愈伤组织的密度增加，并且骨折线几乎不可见。在第四周以后，更多的骨折线消失，骨折骨完全融合（图6）。


图6
骨折后不同周大鼠胫骨骨折的X线片。 X线片显示骨折愈合期间的骨融合阶段（箭头）。 骨折愈合在第1周和第2周几乎看不到，在第3周略微清晰，在第4周显示出良好的清晰度，并在第6周完成

X射线照片愈伤组织指数在第1周几乎不可测量，非常小，在第2周几乎没有看到，清楚并在第3周达到最高点，然后在第4周和第6周逐渐减少。射线照相愈伤组织指数的平均值±SE 术后1,2,3,4和6周分别为1.14±0.12,1.21±0.09,1.72±0.19,1.95±0.16和1.35±0.09。 然而，射线照相愈伤组织指数的统计分析显示不同周之间没有显著差异（单向ANOVA）（图7）。


图7
射线照片愈伤组织指数的条形图。该图显示了手术后的第1,2,3,4和6周（n = 25）。误差棒表示均值的标准误差。具有不同字母的手段显著不同

在四只动物中观察到轻微的粉碎性骨折，另一只没有任何骨粉碎。对于所有胫骨骨折（n = 25）的骨粉碎评估，仅4例（16％）显示轻度粉碎性骨折，而另外21例（84％）未粉碎。然而，在比较两组愈伤组织形成时，轻微粉碎性骨折组（n = 4）和非粉碎组（n = 21）之间没有观察到显著变化，平均愈伤组织面积百分比为0.81±0.64 ％和0.52±0.32％（P> 0.444;两个t-检验样品）。表2总结了在大鼠胫骨中诱导的骨折类型之间的比较。

表2
大鼠诱发胫骨骨折类型与骨折愈合的比较（n = 25）


轻微粉碎性和非粉碎性骨折具有相同的值（双尾t检验）。 数据以平均值±SE表示，重要的是P <0.05

骨折组织检查显示骨折后第1周增生期血肿和软骨细胞，而第2周软骨细胞区和松质骨增加。 在第3周和第4周，松质骨随着肥大软骨细胞和骨髓的出现而增加。 骨折愈合最终在第6周观察到，其中松质骨和板层骨与骨髓一起主要存在，软骨细胞消失（图8）。


图8
5周的骨折愈合显微照片显示第1周的血肿（H），正常骨（b）和增殖软骨细胞（P），第2周的软骨细胞（Ch。），正常骨（b）和松质骨（C），第3周的肥厚软骨细胞（Ch。）和松质骨（C），第4周的松质骨（C）和骨髓（B）以及第6周的骨髓（B）的松质骨（C）和板层骨（L）

讨论
闭合骨折模型的使用被认为是研究骨折愈合过程的选择模型。这很重要，因为骨折部位周围的骨膜和软组织在骨折愈合过程中起着重要作用（Davis等，2015）。胫骨或股骨的截骨术或在大鼠骨中钻孔是整形外科科学家研究的最常见的骨愈合模型（Otto等，1995）。 Bonnarens和Einhorn（1984）描述的类似断头台的装置的特征在于一些缺点，包括频繁的粉碎报告，不同的并发症和弯曲率。然而，本研究中的角度仅在横向平面中测量。 Aurégan等。 （2013）使用股骨骨折的大鼠模型，并且在该模型中，将固定重量下降到放置在钝的断头台上的骨头以产生闭合的中轴骨折。在骨折之前，骨头用IM针预先固定。结果显示，由于死亡，深部感染或不可接受的骨折，所产生的骨折中有12％不适合研究，而剩余的骨折显示轻微粉碎（63％）。

杰克逊等人。 （1970）使用气动冲床在大鼠中产生闭合的股骨骨折。在这种技术模型中，15％的骨折被排除在外，因为它们不在正确的位置而不是横向。 Hulth（1989）使用手动力来产生大鼠胫骨的闭合骨折模型，但是难以以标准方式控制或复制，使得该方法不适合作为模型。其他报道的骨折模型使用一对钳子挤压产生闭合的胫骨骨折（Newman等，1985）。它与周围软组织的严重损害有关。

已经陈述了早期骨折模型技术的许多挫折和局限性，本研究中使用的当前改进的装置考虑了这些问题以及骨折周围软组织的重要性。作者目前用于创建闭合骨折的改良三点弯曲钳是通过修改Otto等人的上圆压缩钳口来构建的。 （1995）装置，根据Grieff，（1978）装置的压缩机叶片，尺寸为10mm×1mm（图（图1）.1）。此外，三点弯曲钳的两个支撑钳口的间隙距离减小到7毫米而不是17毫米，如Otto等人所述。 （1995）设备。使用这种改进的装置导致骨折，对周围的软组织没有任何明显的损伤或影响。该装置易于使用和控制，并且在骨折之前预先固定的IM针用于稳定骨碎片并使动物立即恢复其走动功能。尽管预先固定的IM不能为骨折骨提供刚性稳定，但它可以最大限度地减少骨折期间的骨粉碎，同时可以解决骨折后肢体缩短和骨碎片旋转的问题（Omerovic等，2015） ）在老鼠。

该技术还产生了一致的结果，最小的并发症，如皮肤磨损和骨折部位撕裂。这与之前其他研究结果的结果相反，该研究报告了大鼠模型中复发性并发症，错位骨折和深度感染的过度粉碎（Jackson等1970; Newman等，1985; Hulth，1989;Aurégan等al。，2013）。

目前的研究报告，在横向和前后（AP）射线照相平面之间没有使用髓内23G针的显著弯曲。另一方面，Bonnarens和Einhorn（1984）在一项相关研究中报告了AP与侧向角度之间的显著差异。 Bonnarens和Einhorn（1984）研究中在AP平面角度观察到的显著弯曲可以通过钝性断头台对肢体的更多侧向影响来解释（Aurégan等人，2013）与现在使用的技术相比研究。

在另一项使用山羊的研究中，闭合性胫骨骨折被创建并用铸件稳定，两周后愈伤组织体积达到最大值（Den Boer等，1998）。然而，在作者目前的研究中，第一周的愈伤组织总面积与随后几周相比显著增加。这种差异可能是动物种类和固定方式不同的结果。

Eastaugh-Waring等。 （2009）表明，据报道，骨折僵硬度和愈伤组织指数随着时间的推移会增加。无论使用哪种固定方法，这都可以被认为是一致的特征（Eastaugh-Waring等，2009）。然而，作者的结果显示愈伤组织指数在6周内减少，因为骨折在骨折愈合后期变得更加稳定。

本研究中大鼠骨折的总愈伤组织面积和总愈伤组织指数一般在第1周初始增加，并在第6周逐渐减少。但是，射线照相愈伤组织指数显示略有不同的趋势，其显示最高值。第3周和第4周。这可能是因为软和硬愈伤组织形成的时间差异。在这项研究中，骨折后3或4周射线照片上的硬愈伤组织形成更为明显。

作者的结果还表明，放射线照片愈伤组织指数在第2周较低，并在第3周和第4周达到最高水平，然后在第6周降低。这一发现不同于在外部稳定的狗中进行的实验性截骨术中观察到的进行性增加。固定器，愈伤组织的数量随着时间的推移而增加，直到第六周（Markel，1990）。这种变化可能归因于两个实验中使用的不同物种和固定方法。

作者发现在轻微粉碎性骨折和非粉碎性骨折骨之间产生的总愈伤组织面积的百分比没有显著差异。这表明使用当前改进的装置产生的轻微粉碎性骨折在骨折愈合的早期阶段产生最小的影响。相反，Aurégan（2013）发现大鼠轻度粉碎性和非粉碎性骨折之间产生的愈伤组织数量存在显著差异。

骨折愈合在损伤诱导后6至8周内完成（Sfeir等，2005）。继发性骨愈合的临时特征涉及可以识别的六个阶段。这些包括除炎症外还形成血肿的初始阶段。随后是血管生成和软骨形成，其导致软骨钙化的阶段。第四阶段是软骨移除阶段，其导致骨形成和最终阶段，其最终是骨重建（Oryan等，2015）。与骨折愈合的正常阶段一致，目前的结果显示在前三周后观察骨折部位的愈伤组织形成，随后骨矿化逐渐增加并最终在骨折后第六周完全骨愈合和稳定。

结论
本研究中使用的改进的三点弯曲钳可用于在大鼠中产生可再现的闭合性骨折，术后并发症非常少。还发现它是一种相对简单的装置，可用于制备体内骨折模型，尤其是二次骨折愈合。

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