自体基质血管成分治疗空鼻综合征的疗效和安全性

概要
目标
使用干细胞的再生治疗可以作为空鼻综合征（ENS）的治疗选择，其由鼻腔中缺乏鼻甲组织和神经系统紊乱引起。作者的目的是评估自体基质血管部分（SVF）在ENS治疗中的有效性和安全性。

方法
在这项前瞻性观察性临床研究中，作者招募了10名ENS患者，他们通过注射自体SVF自愿接受ENS治疗。前瞻性收集数据，包括人口统计学数据，术前和术后中鼻结果测试-25（SNOT-25）评分，总体患者满意度和术后并发症。使用聚氨酯泡沫吸收法评估鼻分泌，并使用酶联免疫吸附测定法在ENS组和对照组中分析生物学标记物的水平。将从腹部脂肪中提取的SVF稀释并注射到下鼻甲中。

结果
在10名初始患者中，一名被排除在研究之外。主观满意度在两个方面被评为“大大提高”，在七个方面被评为“无变化”。在改善的患者中，平均注射前SNOT-25评分为55.0，注射后6个月的评分为19.5。然而，注射后6个月9名参与者的平均SNOT-25评分（平均值±标准差，62.4±35.8）与基线SNOT25评分（70.1±24.7，P> 0.05）无显著差异。在评估的各种炎症标志物中，ENS患者中白细胞介素（IL）-1β，IL-8和降钙素基因相关肽的水平显著更高。与注射前分泌水平相比，SVF治疗患者的鼻腔分泌物在注射后表现出IL-1β和IL-8的表达降低。

结论
尽管SVF治疗似乎降低了鼻粘膜中的炎性细胞因子水平，但单个SVF注射在症状改善和患者满意度方面无效。需要进一步的试验来为ENS患者确定更实用和有用的再生治疗方式。

关键词：空鼻综合征，干细胞，基质血管分数，中鼻结果检查-25，细胞因子

介绍
空鼻综合征（ENS）的特征是鼻子干燥，鼻腔呼吸疼痛，鼻塞，结痂和其他使人虚弱的鼻部症状[1]。 ENS患者有鼻甲减少手术史，包括鼻甲切除术，鼻甲成形术和射频减容术[2]。一旦患者出现这种致残疾病，他们不仅会出现鼻部症状，还可能会出现焦虑和抑郁，这可能导致极端情况下的自杀念头[3]。

ENS可以通过保守和手术方式进行管理。在症状相对轻微的某些亚组患者中，保守治疗如保湿，间歇性堵塞和鼻腔软膏的使用偶尔会有效[4,5]。在表现出明显的鼻甲组织缺失和严重症状的患者中，使用异体植入物，透明质酸填充剂和自体软骨进行鼻甲重建被认为可有效缓解症状，从而改善生活质量[6-8]。然而，目前存在的治疗方式都没有产生真正令人满意的治疗结果。事实上，一些患者对目前可用的各种保守和手术治疗方案没有反应[9]。即使在手术治疗后表现出改善的患者中，改善程度也代表部分反应，因此表明需要新的治疗方式来补充缺失的鼻甲的手术重建的效果。

鼻甲骨是一种重要的功能性器官，可以对吸入的气流提供物理抵抗力，同时还可以对吸入的空气进行加湿和温度调节。除了这种空调功能外，鼻甲上皮层和上皮下固有层也是重要的先天防御器官[3,10]。因此，鼻甲组织的损失可能导致气流动力学的紊乱，吸入空气特性的改变，以及对鼻子固有防御机制的损害[11]。此外，手术期间对神经末梢的手术创伤可能导致各种ENS症状，例如疼痛的呼吸和无法感受到吸入的空气。然而，对ENS的病理生理学的研究仍然不充分，因此限制了作者对这种困难病症的理解和适当管理。

使用干细胞的再生医学在各种医学条件下的适用性越来越高。 ENS的基本前提是丧失功能性鼻腔器官。因此，干细胞治疗可被认为可用于再生鼻甲组织并恢复其功能。此外，ENS的诊断主要取决于临床病史，直到最近[5]。因此，没有可用的ENS生物标志物可用于更好地了解病理生理学，获得准确的诊断，并跟踪手术结果。

来自自体脂肪组织的基质血管组分（SVF）含有间充质干细胞和已知具有再生和抗炎潜力的其他细胞组分。各种研究已经描述了从脂肪组织获得的SVF治疗在改善各种医学病症中的有益效果[12-16]。因此，为了评估SVF在ENS管理中的治疗潜力，并确定有助于更好地了解ENS病理生理学的生物学标记，作者对来自作者机构的一组ENS患者进行了前瞻性临床观察研究。

材料和方法
研究人口
在这项前瞻性观察性临床研究中，共有10名患有ENS的患者（7名男性和3名女性;年龄22至55岁）被转诊并在韩国首尔牙山医疗中心诊断。 ENS的诊断基于以下标准：（1）先前的鼻甲复位手术和阳性棉花试验[17]; （2）部分缺失的下鼻甲组织和异常宽的鼻腔，通过内窥镜检查和对比度非增强型计算机断层扫描确认; （3）主观症状，包括反常的鼻塞，鼻腔干燥，吸气时面部或鼻部疼痛，鼻痂或出院，以及头痛[18]。接受完全下鼻甲切除术的患者被排除在本研究之外，因为它们更适合使用肋软骨进行鼻甲重建。所有患者均接受术前心理筛查，以排除混杂的精神疾病。该研究得到了牙山医疗中心的机构审查委员会（IRB No. 2015-0687）的批准，并且从所有登记的患者获得了知情同意书。

分析鼻腔分泌物
根据先前描述的方法[19]进行鼻分泌分析。简言之，使用改良的聚氨酯海绵（Nasopore Standard，Groningen，The Netherlands）收集鼻分泌物，将其置于粘膜皮肤连接处后面的每个鼻腔中，使用内窥镜直接观察，并留在原位10分钟。除去后，在加入等渗盐水溶液后通过离心从取样器中提取液体。粘蛋白-5AC（MUC5AC）和乳铁蛋白（LTF）的水平，作为腺体分泌的标志物; P物质和降钙素基因相关肽（CGRP），作为神经源性炎症的标志物;评估了白细胞介素（IL）-1β，IL-8和肿瘤坏死因子（TNF）-α作为非特异性气道炎症的常用标志物。所有物质的浓度一式两份测定，并按照每种取样技术获得的未稀释样品中的实际浓度计算。将样品稀释至适合各种测定的工作范围。在SVF注射前2周和注射SVF后6个月对每位患者进行鼻分泌收集。为了比较ENS患者的生物学标志物浓度与正常对照的生物学标志物浓度，还在五个健康志愿者（对照组）中进行鼻分泌物收集。这五名正常志愿者（三名男性和两名女性;年龄27至35岁）表现出正常的内镜检查结果，并且没有鼻腔鼻窦手术史，计算机断层扫描的鼻腔鼻窦异常或鼻部症状。

SVF的制备和注射
脂肪组织收获程序在手术室中进行，静脉麻醉用异丙酚（1.5mg / kg）。对于自由腹部脂肪采集，首先在脐部下方约1cm处勾勒出1.5-2cm的横向中线切口部位。此后，将1％利多卡因与1：100,000肾上腺素注射到所提出的手术部位。使用＃10刀片通过皮肤和皮下组织切开以暴露腹部脂肪垫。在脂肪移植物上保持足够的张力后，脂肪被广泛破坏，对腹直肌肌筋膜表面，与上覆皮肤解剖的程度相似。从下腹部以块状提取约50-100g脂肪脂肪，在冰上保持在组织培养基中，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤以除去污染的血细胞。收获的组织立即送到实验室进行进一步处理。使用胶原酶（0.075％）在37℃下酶洗消化经洗涤的脂肪组织45分钟。将酶反应灭活并以2,000rpm离心10分钟以获得高密度SVF颗粒。将细胞悬浮液通过70μm尼龙网过滤以除去未分散的组织元件和红细胞。使用倒置显微镜对获得的SVF进行形态学分析，并使用台盼蓝验证细胞活力。将该分化的SVF稀释至3×10 7个细胞/ mL的浓度，并且在两个下鼻甲的大多数内侧表面中各注射1.5mL。在2小时内进行SVF分离和注射。为了评估SVF注射与结果之间的关联，作者没有开出任何可能影响本研究期间鼻腔分泌物分析的药物。

结果测量
所有患者均使用中鼻结果测试-25（SNOT-25）问卷以及整体患者满意度评估鼻部症状的严重程度。 SNOT-25问卷包含25个量化ENS相关症状的项目;每个项目的评分从0（无症状）到5（严重症状）[20]。作者在SVF注射前2周和注射SVF后2周，1个月，2个月，3个月和6个月对登记的患者进行SNOT-25问卷调查。

统计分析
使用IBM SPSS ver进行统计分析。 21.0（IBM Corp.，Armonk，NY，USA）。对于定量变量，值表示为平均值±标准偏差。 Wilcoxon符号秩检验用于比较SVF注射前后的结果。差异被认为是显著的，P <0.05。

结果
10名患者（年龄35.8±17.7岁; 3名女性）在下鼻甲和其中两名患者中接受了SVF注射。在随访期间，一名患者被排除在研究之外，因为他决定辍学。 SVF注射后6个月的平均总SNOT-25评分（62.4±35.8）与注射前相比没有显著差异（分别为70.1±24.7，P> 0.05）。对主观结果的分析表明，两名患者（22％）对其改善的结果感到满意，并且七名患者（78％）在注射SVF后感觉没有变化。在改善的患者中，平均预注射SNOT-25评分为55.0，注射后6个月的评分为19.5（表1）。

表格1。
空鼻综合征患者的人口统计学，SNOT-25评分，患者满意度和并发症


               
SNOT-25，中鼻结果测试-25; RFA，射频消融; SMR，黏膜下切除术; PT，部分鼻甲切除术; SD，标准差。

为了按时间顺序确定结果，作者分析了这些患者的SNOT-25评分。 随着时间的推移，整体SNOT-25评分的变化不显著，直至6个月的随访（P> 0.05）。 然而，与注射前基线评分相比，仅在注射后3个月时SNOT-25评分的平均改善显著不同（95％置信区间，7.86至40.81; P = 0.009）。 两名对结果满意的患者的平均SNOT-25评分表明在注射SVF后2周显著改善，并且此后保持效果（图1）。


图1。
中鼻结果测试-25（SNOT-25）在基质血管分数（SVF）注射后的不同时间段评分。平均SNOT25评分范围为0至125，其中较高评分表示较大的空鼻综合征严重程度。 （A）包括接受SVF注射的9名患者的数据，并且平均基线SNOT-25得分为70.1±24.7。随着时间的推移总体变化不一致（P> 0.05）。与基线评分相比，注射后3个月的平均SNOT-25评分为45.78±27.74。 （B）还包括两名改善患者的数据，其平均基线SNOT-25得分为55.0±20.0。 SVF注射的效果在2周后明显，并且此后保持。 a）P = 0.009对比基线。

为了确定合适的ENS生物标志物，在该研究中选择并评估了多种炎症标志物。在评估的各种炎症标志物中，ENS组中IL-1β，IL-8和CGRP的水平显著高于对照组（P <0.001）。然而，ENS和对照组之间的LTF水平没有显著差异。其他标志物，包括TNF-α，MUC5AC和P物质，在ENS和对照组中检测不到。与注射前的鼻腔分泌物相比，SVF治疗的患者的鼻分泌物在注射SVF后显示IL-1β，IL-8和CGRP水平降低。在这些生物标志物中，SVF注射后IL-1β和IL-8的浓度显著降低（P <0.005）。虽然注射SVF后CGRP和LTF的浓度降低，但这些生物标志物的水平没有显著降低（图2）。


图2。
对照组，空鼻综合征（ENS）组和基质血管组分（SVF）注射组后的生物标志物浓度。 （A）白细胞介素（IL）-1β，（B）IL-8，（C）降钙素基因相关肽（CGRP），（D）乳铁蛋白（LTF）水平的比较。 ENS组的IL-1β，IL-8和CGRP水平显著高于对照组。 SVF注射后IL-1β和IL-8水平显著降低。 ENS和对照组之间的LTF水平没有显著差异。 SVF注射后CGRP和LTF水平没有显著降低。 a）与对照组相比P <0.01。 b）与ENS组相比，P = 0.013。 c）与ENS组相比，P = 0.014。

没有受体部位并发症，如出血，疼痛或栓塞。然而，在一名患者中观察到以血清肿形式出现的并发症，在随访期间通过超声引导的抽吸治疗。

讨论
最近几项关于人类和动物的研究已经反复证明，自体脂肪来源的干细胞（ADSC）和SVF具有再生和抗炎潜力[13,15,21-23]。基于再生医学的治疗，包括富含血小板的血浆，富含血小板的脂质转移，ADSC，SVF，细胞外基质和脂肪移植，可以是用于治疗ENS的合适替代方案。这种治疗的好处包括容易进入，移植后轻微的组织损伤，快速增殖和广泛的来源。然而，之前只有少数报道描述了使用干细胞治疗ENS [23,24]。先前的一项研究报道了ADSC对鼻粘膜的影响以及ENS治疗的潜在机制[23];作者在30例ENS患者中使用脂肪颗粒联合ADSC。所有患者的鼻内窥镜检查和粘膜纤毛清除率评估均显著改善，炎症明显减轻。作者得出结论，ADSC移植可能有效改善ENS患者的症状和粘膜功能。在该研究中，作者以10天的间隔对受损的鼻粘膜和下鼻甲区域进行了三次连续ADSC注射。 ADSC形成多边形鹅卵石形状，是人类上皮细胞的特征。作者得出结论，ADSCs通过上调特异性上皮标志物如细胞角蛋白7,14和19的表达来改善上皮细胞的功能，从而改善ENS患者的鼻粘膜功能。

干细胞的特征在于其自我更新和多能性。 ADSCs和SVF都包括间充质干细胞，可以分化成多个成熟细胞谱系。 SVF是在微型脂肪抽吸术后从脂肪组织获得的细胞群。 SVF含有各种类型的细胞，包括干细胞，造血细胞，免疫细胞，平滑肌细胞，内皮细胞和其他细胞成分，与ADSC明显不同[13,25]。 SVF具有与ADSC相似的再生潜力，但可以以干细胞治疗价格的十分之一进行纯化，这使其成为恢复受损组织和减少炎症的有效和有效的治疗方法。鉴于收获过程是安全的并且细胞容易大量获得，SVF是一种有吸引力的治疗方法。因此，已发现SVF可有效治疗各种医学领域的病症，包括骨关节炎，退行性椎间盘疾病，硬化，肌腱病，充血性心力衰竭，慢性阻塞性肺病，放射性坏死，口腔干燥症和多发性硬化[12-16] 。获得SVF的整个过程可在60-90分钟内在清洁设施中进行;然而，在SVF中完全分离同源ADSCs群需要在细胞培养设施中24小时。因此，ADSC的缺点包括它们需要相当长的时间和相当大的费用才能获得[13,25]。因此，SVF可以用于这些患者，这将消除对细胞培养程序的需要。在本研究中，SVF的分离和制备由位于作者医院校园内的公司（Prostemics，Seoul，Korea）进行。来自脂肪组织的SVF使作者能够收集尽可能多的组织并获得足够数量的干细胞以实现治疗效力。在时间限制方面，流式细胞术不能对所有获得的SVF颗粒的一部分进行。然而，在剩余样品的情况下有时进行流式细胞术，并且通过标准方案和专家研究人员将SVF维持在间充质干细胞的比例约40％。因此，作者对ENS患者进行了单脂肪SVF注射。在目前的临床试验中，尽管9名患者中有2名表现出改善，但作者未能证实脂肪SVF在大多数患者的ENS治疗中具有显著的有益作用。

对于使用脂肪SVF对ENS缺乏有利影响可能有一些解释。单次施用脂肪SVF可能不足以实现对这种长期衰弱性疾病的所需治疗效果。然而，由于与收获相关的发病率，重复收获脂肪SVF对于患者和临床医生来说实际上是繁重的。这是作者选择脂肪SVF的严重限制。因此，使用市售的，易于获得的培养干细胞可作为替代选择，需要在进一步的研究中进行探索。

在本研究中，作者可以确定几种ENS候选生物标志物。 ENS的病理生理机制涉及复杂的信号通路和各种生物分子。影响ENS的因素包括：改变气流模式;粘膜面积减少;加湿减少，变暖加剧;降低鼻腔气流阻力;吸入空气治疗所需的感觉，触觉和热感受器的损失;和神经损伤[2,26]。鼻分泌物中生物标志物的水平可以提供关于鼻病理生理学的有价值的信息。在本研究中，作者选择IL-1β，IL-8，TNF-α，MUC5AC，LTF，P物质和CGRP作为候选标志物。促炎细胞因子，如TNF-α，IL-1β和IL-8，是有效的多功能细胞因子，在许多炎症性疾病的发病机制中起重要作用[27]。 MUC5AC和LTF是鼻粘膜腺分泌的标志[28,29]。神经肽，如CGRP和P物质，介导神经源性炎症[30]。在本研究中，与正常对照组相比，ENS组中的鼻分泌物分析显示细胞因子如IL-1β，IL-8和CGRP的水平增加。这些发现可能表明ENS是一种由气流改变引起的慢性炎症，为ENS的病理生理学提供了新的见解。

鼻腔分泌物分析通常通过鼻腔灌洗进行;然而，使用传统的鼻腔灌洗技术难以获得始终如一的良好结果。因此，在本研究中，作者使用改性聚氨酯海绵进行分泌物收集和分析，这被认为优于传统的鼻腔灌洗技术。先前的一项研究描述了使用鼻腔灌洗技术，鼻喷雾吹扫技术，滤纸法和聚氨酯海绵取样器技术分析鼻腔浓度;作者指出，鼻腔灌洗技术的效果比改性聚氨酯海绵法低约10倍[19]。此外，由于通过鼻灌洗技术获得的不可预测的稀释，分析的浓度可能低于高灵敏度测定的检测极限。在本研究中，使用改良聚氨酯海绵的鼻分泌物分析很少产生低于检测限的浓度。

单次注射SVF在症状改善和患者满意度方面没有显示出成功的结果。然而，作者关于ENS患者中炎性细胞因子表达的发现表明，SVF注射降低了鼻粘膜中炎性细胞因子（包括IL-1β和IL-8）的水平。在SVF注射后症状改善的两名患者中，作者无法确定SVF有益效果的原因。这些改善可能是由于鼻甲组织的再生，但最有可能是由于SVF引起的炎症改善，如细胞因子谱的变化所证明的。 SVF的潜在抗炎作用已在先前的研究中得到广泛认可，但需要进一步评估，特别是在鼻腔鼻窦炎症的情况下。

本研究有一些值得注意的局限性。首先，患者数量有限;特别是，作者只招募了五名志愿者作为鼻腔分泌物的正常对照。其次，没有检查由干细胞注射引起的组织学变化，因为作者深切关注粘膜活检对作者的患者的潜在不利影响，其问题是由于对鼻甲的先前外科手术程序引起的。

SVF注射似乎降低了鼻粘膜中的炎性细胞因子水平，单次注射SVF在症状改善和患者满意度方面没有取得一致的成功结果。有必要进一步研究，以找出ENS患者更实用和有效的再生治疗方式。

强调
&#9642;在9例空鼻综合征患者中检查自体基质血管部分注射的效果。

&#9642;注射后6个月的整体中鼻结果测试-25评分与注射前的评分没有显著差异。

&#9642;空鼻综合征患者白细胞介素（IL）-1β，IL-8和降钙素基因相关肽水平显著升高。

&#9642;间质血管组分治疗患者的鼻腔分泌物显示注射后IL-1β和IL-8的表达下降。

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