耳鼻咽喉-头颈外科「图解」206-73-分子生物学与基因治疗基础

图-1. 基因表达涉及的基本步骤。 基因通过RNA聚合酶在核内复制，导致产生互补的RNA链。 这被处理以产生信使RNA（mRNA），其离开细胞核并经由核糖体“翻译”以形成蛋白质产物。


图-2. 所显示的是细胞周期的各个阶段，其通常在动物中持续10至25小时。 G1最长也是最可变的阶段，范围可以从4到24小时不等。 M阶段只用了1个小时。 还描绘了细胞周期的调节，其中许多元件是基因和分子治疗的目标。 Cdk，细胞周期蛋白依赖性激酶。


图-3. RNA干扰的机制。 用于RNA干扰的效应分子是短干扰RNA（siRNA），其可以由长双链RNA（dsRNA）的内源性产生; 然后由Dicer处理以产生siRNA（灰色箭头）。 或者，可以通过直接注射将合成的siRNA引入细胞中，而不需要Dicer（虚线箭头）。 或者，可将编码短夹RNA（shRNA）的质粒或病毒载体引入细胞（虚线箭头）。 然后用Dicer处理shRNA以产生siRNA（灰色箭头）。 无论生产途径如何，siRNA都会激活RNA诱导的沉默复合物（RISC），然后“信任”信使RNA（mRNA）序列，该序列与反义siRNA“引导链”（黑色）箭头）。 然后mRNA被切割，并且不产生基因产物，有效地“压制”该基因。


图-4. 基因治疗的体细胞靶点。 许多不同的细胞类型是基因治疗的潜在目标。 实线箭头代表目前在人体临床试验调查下的组织靶标; 虚线箭头代表动物模型中正在研究的目标。 目前的基因治疗实验室和临床研究明确排除对生殖细胞（精子和卵子）的操纵，这可能会将基因传给后代。


图-5. 质粒DNA载体的示意性结构，即编码治疗性基因产物的DNA的环状分子。 DNA载体含有实现治疗水平基因产物表达所需的特殊元件。 启动子区和增强子区调节质粒DNA转录成RNA，特定处理元件调节RNA翻译成蛋白质。 DNA载体可以与增强载体摄取或提供细胞摄取特异性的蛋白质，脂质或合成有机化合物复合。


图-6. 构建复制缺陷型逆转录病毒载体。 A，莫洛尼白血病病毒基因组编码三种多蛋白-gag，pol和env-它们一起构成逆转录病毒颗粒。 gag和pol基因编码逆转录病毒的内核以及感染靶细胞后处理逆转录病毒基因所需的酶。 env基因形成病毒的外膜并识别靶细胞上的特异性受体。使用几种重组基因制备有缺陷的逆转录病毒载体：一种表达gag-pol多蛋白，一种编码env蛋白，一种含有与两种LTR（启动子和增强子）序列结合的治疗基因和psi（包装）序列。 B，包装细胞系表达来自A中所示构建体的gag，pol和env。当含有具有LTR和psi序列的治疗性基因的载体被引入该细胞时，非病原性病毒颗粒将从gag ，pol和env蛋白;该产生的病毒颗粒能够通过感染过程将治疗序列携带入细胞中。 (From O’Malley BW Jr, Ledley FD. Somatic gene therapy. Methods for the present and future. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1993;119:1100. Copyright 1993, American Medical Association.)


图-7. 构建复制缺陷型腺病毒载体。 A，使用缺失E3基因的缺失的腺病毒基因组以及产生增殖性腺病毒颗粒所需的E1基因构建腺病毒载体。 将重组基因插入E1基因的位点。 B，在能够表达E1的293细胞系中产生腺病毒颗粒，因此能够将仅包含重组病毒基因组的病毒颗粒与治疗基因组装。 (From O’Malley BW Jr, Ledley FD. Somatic gene therapy. Methods for the present and future. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1993;119:1100. Copyright 1993, American Medical Association.)


图-8. 基因的转移可以通过几种不同的递送机制来实现。 基因转移最初是在肌肉中使用直接注入肌肉的裸露DNA进行描述的（1）。 这通常被认为是低效率的基因转移方法，但可能对DNA疫苗接种策略的开发非常有用。 包装成病毒载体（2）允许最有效的基因转移，但与安全问题有关。 非病毒载体技术（3）涉及涂布或浓缩基因构建体以允许容易地进入细胞。 它比病毒载体介导的基因转移效率低，但被认为更安全。 所有基因递送的最后共同途径是产生导致细胞表型改变的蛋白质。 正在开发的替代基因治疗策略使用抑制性RNA来降低某些基因的表达。 mRNA，信使RNA。


图-9. 离体和体内基因治疗策略。 基因治疗的体内策略涉及通过常规注射途径（红色箭头）将DNA或病毒载体直接施用于患者。 体外策略包括从患者体内取出组织，在培养物中生长细胞，在实验室中将基因导入这些细胞，然后通过自体移植（蓝色箭头）将遗传修饰的细胞返回给患者。 (From O’Malley BW Jr, Ledley FD. Somatic gene therapy. Methods for the present and future. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1993;119:1100. Copyright 1993, American Medical Association.)


图-10. 基因治疗癌症的策略。 已经描述了通过基因疗法治疗癌症的几种不同的策略。 这些包括在肿瘤细胞内表达细胞因子如白细胞介素-2以增强针对肿瘤特异性抗原的免疫应答; 引入外来移植抗原例如HLA-B7以诱导免疫排斥; 将细胞因子导入肿瘤浸润淋巴细胞（TIL细胞）以增强其细胞病变效应; 并引入诸如疱疹TK等基因以使肿瘤细胞对诸如阿昔洛韦或更昔洛韦等药物敏感。 (From O’Malley BW Jr, Ledley FD. Somatic gene therapy. Methods for the present and future. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1993;119:1191. Copyright 1993, American Medical Association.)